乳腺浸润性导管癌中Galectin3、OPN的表达及其临床病理学意义

　　　　 作者：余慧萍，樊祥山，孟凡青，张东生，周强，吴鸿雁，孟奎

【摘要】 目的： 检测Galectin3和骨桥蛋白(OPN)在乳腺浸润性导管癌(IDC)中的表达情况，并探讨其在IDC进展过程中的意义。方法： 应用组织芯片技术和免疫组化法研究100例乳腺IDC和35例乳腺良性病变中Galectin3、OPN的表达情况，并统计分析其与年龄、肿瘤最大直径、组织学分级、TNM分期以及淋巴结转移间关系。结果： Galectin3在乳腺IDC和良性病变中的表达强度具有明显差异(χ2=47.814，P=0.000)，OPN在二者中的表达差异无统计学意义。在IDC组， Galectin3表达强度与TNM分期、淋巴结转移均呈正相关关系(分别为：rs=0.300，P=0.002;rs=0.335，P=0.001)，与年龄、肿瘤最大直径、组织学分级的关系无统计学意义; OPN的表达强度与肿瘤最大直径、TNM分期以及淋巴结转移均呈正相关(分别为：rs=0.236，P=0.018;rs=0.389，P=0.000;rs=0.404，P=0.000)，与年龄、组织学分级的关系无统计学意义;Galectin3与OPN的表达也呈正相关关系(rs=0.266，P=0.007)。结论： Galectin3在乳腺良、恶性病变中的表达水平具有明显差异，在乳腺病变中检测Galectin3的表达对病变性质的判断具有重要意义;高表达Galectin3、OPN的乳腺IDC具有更高侵袭性和淋巴结转移能力，对二者作用机制的深入研究有可能使其成为乳腺IDC患者个体化治疗的新靶点。

【关键词】 乳腺肿瘤;浸润性导管癌;淋巴结转移; Galectin3;骨桥蛋白

Galectin3 是一种β半乳糖苷结合蛋白， 具有影响细胞黏附[12]、抗凋亡[3]、促进肿瘤微血管发生[4]等作用，与肿瘤的侵袭和转移密切相关。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，近年来，OPN与肿瘤的发生发展，特别是与肿瘤转移的关系日益引起人们的关注，其在许多人类肿瘤组织中过表达，被公认为是与肿瘤转移相关的基因。目前二者在乳腺癌方面的相关研究还较少，因此我们希望通过组织芯片技术进一步研究人类乳腺癌组织中这两种蛋白的表达情况及其临床病理学意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　收集南京大学医学院附属鼓楼医院2002年6月至2006年5月间存档的乳腺浸润性导管癌(IDC)标本共计104例，患者年龄28～80岁，中位年龄49岁，平均年龄51.32岁;另收集该院2006年1月至2006年12月期间乳腺良性增生41例(纤维腺瘤30例，腺病11例)。所有病例术前均未行放、化疗， 临床资料完整，标本均经4%中性甲醛固定，常规处理后石蜡包埋。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　Galectin3兔抗人多克隆抗体工作液及OPN鼠抗人单克隆抗体工作液均购自北京中杉公司，组织微阵列打孔系统购自美国Beecher公司，组织芯片载体采用德国MenzelGlaser Super Frost Plus玻片。

　　1.3 组织芯片制备和免疫组织化学染色

　　所有病例经复诊并根据HE切片标记出典型病变范围后，应用组织微阵列打孔仪在每例组织典型病变处取样，分别移植至受体蜡块上，制成乳腺病变组织芯片蜡块;按同样方法构建另一个包含相同病例且阵列设计相同的组织芯片蜡块以进行实验重复;分别连续4μm切片，制备成组织芯片备用。对组织芯片进行Envision 二步法免疫组织化学染色，实验步骤按试剂盒说明书进行，每个检测指标均在另一张组织芯片上重复1次。

　　1.4 结果判定

　　Galectin3及OPN阳性部位在细胞质，以出现黄色颗粒且染色强度高于背景非特异性着色者为阳性细胞。综合考虑染色强度和阳性细胞数：无染色(-)，&<60%肿瘤细胞弱到中等染色(+)，&<60%肿瘤细胞强染色或&>60%肿瘤细胞弱到中等染色(++)，&>60%肿瘤细胞强染色(+++)[5]。由两名富有经验的病理医师独立对2张组织芯片上的染色结果分别进行评分，对同一病例的评分结果取平均值作为该病例的最终评分。

　　1.5 统计学分析

　　所有数据应用SPSS 12.0统计软件进行处理。各组资料的比较采用χ2 检验和Fisher’s精确概率检验，相关性采用Spearman秩相关分析，P&<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 组织芯片质量

　　组织芯排列整齐，共有104例乳腺IDC组织和41例良性病变样本，去除肿瘤细胞过少及掉片的样本，并选取Galectin3与OPN二者染色共同有效者，共计135例有效样本(乳腺IDC100例，乳腺良性病变35例)。

　　2.2 Galectin3与OPN在乳腺良性病变及乳腺IDC中的表达 Galectin3在乳腺IDC中的阳性率为87.00%(87/100)，阳性部位主要在癌细胞的细胞质中，在少数样本(2.00%，2/100)中表现为核、质同时表达，呈淡黄色、棕黄色或棕褐色的点块状或弥散分布。Galectin3在良性病变中的阳性率为31.43%(11/35)，未发现核表达。Galectin3在乳腺IDC中的中等表达率和高表达率分别为33.00%(33/100)和20.00%(20/100)，而乳腺良性病变组中无中等表达和高表达样本，普遍呈低表达或阴性表达，两组样本的Galectin3表达强度具有显著差异(χ2=47.814，P=0.000)。见表1、图1。OPN表达均定位于细胞质中，呈淡黄色、棕黄色或棕褐色的点块状或弥散表达。OPN在乳腺良性病变和乳腺IDC中的阳性表达率均较高，分别为97.14%(34/35)和99.00%(99/100)，两组之间表达强度无明显差异(χ2=1.860，P=0.615)。见表2、图2。表1 Galectin3在乳腺良性病变和IDC中的表达例注：括弧内为构成比A. Galectin3在癌细胞的胞质高表达，部分癌细胞出现核表达; B. 中等表达; C.　低表达图1 Galectin3在乳腺IDC中的表达 Envision法×400表2 OPN在乳腺良性病变和IDC中的表达例图2 OPN在乳腺IDC中的表达 Envision法×400

　　2.3 Galectin3、OPN表达与乳腺IDC临床病理学特征的关系 χ2检验显示，Galectin3表达与乳腺IDC的组织学分级(χ2=10.464，P=0.015)、淋巴结转移(χ2=19.778，P=0.000)、TNM分期(χ2=12.730，P=0.048)密切相关;而与年龄、肿瘤最大直径的关系无统计学意义。对χ2检验有统计学意义的指标作进一步Spearman相关分析显示：Galectin3表达强度与TNM分期、淋巴结转移均呈正相关(分别为：rs=0.300，P=0.002;rs =0.335，P=0.001)，而与组织学分级的关系无统计学意义(rs=-0.004，P=0.965)。

　　OPN的表达强度与肿瘤最大直径(χ2=11.016，P=0.043)、TNM分期(χ2=25.159，P=0.000)、淋巴结转移(χ2=17.180，P=0.000)密切相关，而与年龄、组织学分级的关系无统计学意义。将χ2检验有意义的病理学参数作进一步Spearman相关分析显示，OPN与前述各指标均呈正相关(分别为：rs=0.236，P=0.018;rs=0.389，P=0.000;rs =0.404，P=0.000)。见表3。表3 Galectin3与OPN在乳腺IDC中的表达例

　　2.4 乳腺IDC中Galectin3、OPN之间的关系 Spearman相关分析显示，乳腺IDC中Galectin3表达与OPN的表达呈正相关(rs =0.266，P=0.007)。Galectin3与OPN均为高表达的样本共有7例，全部出现淋巴结转移，而二者均为低表达或阴性表达的样本也有7例，均未出现淋巴结转移。

　　3 讨 论

　　Galectin3 为β半乳糖苷结合蛋白，其相对分子质量约为31000，具有3个不同的结构域，即含有12个氨基酸的Nh3末端，富含甘氨酸、酪氨酸、脯氨酸的胶原样序列以及具有糖结合位点的C末端[6]。Galectin3的表达与多种肿瘤的演进和淋巴结转移密切相关，其作用机制可能是：(1) 减少肿瘤细胞间的黏附[1]，同时增加癌细胞与血管内皮的黏附，促进肿瘤扩散[2]。(2) 诱导内皮细胞构建、肿瘤微血管发生[4]。(3)为Wnt/βcatenin的关键调节因子，促进细胞增殖[7]。在本研究中我们也观察到有少量乳腺癌细胞的核内出现Galectin3蛋白表达，提示其确有可能参与Wnt/βcatenin信号途径。(4) 激活PI3K/Akt途径，抵抗TRAIL诱导的凋亡[3]。(5) 激活KRas途径，赋予细胞多种致癌功能[8]。

　　本研究对比乳腺IDC组和乳腺良性病变组中Galectin3的表达情况，发现乳腺IDC组Galectin3阳性率显著高于乳腺良性病变组(分别为87%和31.43%);乳腺IDC中Galectin3的高表达率和中等表达率分别为20.00%和33.00%，而良性病变组则普遍呈低表达或阴性表达，两组样本的表达强度具有显著差异(χ2=47.814，P=0.000)。另外， Galectin3与乳腺IDC淋巴结转移密切相关， 48例无转移的乳腺IDC样本中有11例为阴性表达，仅有2例高表达，而在有淋巴结转移的52例样本中，仅有2例阴性表达，其余均为阳性表达，其中高表达样本有18例，两组之间的表达具有显著差异(P=0.000)。同时，Galectin3表达与乳腺IDC的TNM分期呈正相关关系(rs=0.300，P=0.002)。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期样本中，Galectin3高表达率分别为4.76%(1/21)、17.30%(9/52)和37.04%(10/27)。研究数据显示，Galectin3表达与乳腺IDC的恶性演进及淋巴结转移有着密切关系。

　　人OPN基因由7 个外显子和6 个内含子组成。人类OPN 分子一般由信号肽序列、7～10 个连续ASP 序列、GRGDS(甘氨酸精氨酸甘氨酸天冬氨酸丝氨酸) 结构域、α9β1/α4β1 结构域和肝素结合结构域构成[9]。OPN高表达与多种肿瘤的侵袭、转移和不良预后有关，其可能机制如下：(1) 促进蛋白溶解酶的合成、分泌，溶解细胞外基质屏障[10]。(2) 与肿瘤细胞表面的CD44 结合， 对细胞的黏附、运动以及正常细胞和肿瘤细胞的激活发挥重要作用[1112]。(3) 上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达，诱使新血管形成[1314]。(4) 可能与肝细胞生长因子发挥协同作用[15]，促进肿瘤生长、侵袭及转移。

　　本研究发现，在乳腺IDC中OPN的表达与淋巴结转移密切相关(χ2=17.180，P=0.000)。在无淋巴结转移组，仅有6.25%(3/48)的乳腺IDC出现OPN高表达，另有12.50%(6/48)的样本表现为低表达或阴性表达;而在有淋巴结转移的乳腺IDC样本中， OPN全部为中等表达或高表达，无一例低表达或阴性表达。OPN的表达强度与乳腺肿瘤的大小也呈正相关(rs =0.232，P=0.020)，在T1(&<2 cm)组，仅有9.38%(3/32)的样本出现OPN高表达，另有18.75%(6/32)的样本表现为低表达或阴性表达，而在T3(&>5 cm)组，则有19.05%(4/21)的样本表现为OPN高表达，无一例低表达或阴性表达。另外，OPN表达与TNM分期也呈正相关关系(rs=0.389，P=0.000)。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期样本中，OPN高表达率分别为 0.00%(0/21)、23.08%(12/52)和29.63%(8/27)。可见，OPN表达与乳腺IDC的侵袭和转移也有着密切关系。

　　本研究还发现乳腺IDC中Galectin3与OPN的表达呈正相关关系(rs =0.266，P=0.007)。并且，二者同为高表达的样本均出现淋巴结转移，而二者同为低表达或阴性表达的样本则均无淋巴结转移。Galectin3、OPN都是与肿瘤侵袭和转移密切相关的基因，其作用机制各不相同但又存在着复杂的联系，我们推测其可能主要通过以下方面共同促进乳腺肿瘤演进：(1) 通过不同方式影响细胞黏附。Galectin3可能通过影响黏着斑的功能[1] 从而减少肿瘤细胞间的黏附，并可能通过与大分子黏蛋白MUC1[2]的结合促进癌细胞与内皮的黏附;OPN则通过与CD44的结合进而促进癌细胞与基质的黏附[1112]，其表达还增加MMPs和uPA的表达，从而溶解细胞外基质，促进肿瘤扩散[10]。(2) PI3KAkt途径是这两种基因共同的信号途径。Galectin3是PI3KAkt途径激活的重要信号分子[3]，而OPN则是该信号途径的下游效应分子之一[16]，二者协同作用，共同发挥抗凋亡、促进肿瘤侵袭和转移的作用。(3) 共同参与Wnt/Tcf信号途径。Galectin3是Wnt信号途径的关键调节因子，其与βcatenin、TCF4组成三元复合物，共同启动下游靶基因Cyclin D1、 cmyc等的转录[7]。近年来，人们发现OPN可能也是该信号途径的下游靶基因[1718]，Wnt信号途径的激活也增加了OPN的表达。(4) 均与肿瘤微血管的发生密切相关。血管内皮细胞的构建是一个糖依赖性过程，Galectin3具有的糖识别结构域作用于内皮细胞，导致内皮细胞迁移、黏附，促进微血管的发生[4];而OPN则通过上调VEGF 的表达，促进内皮细胞的增生，诱使新血管形成[1314]。

　　因此，Galectin3、OPN可能是乳腺IDC侵袭和转移的关键分子，其作用机制各不相同但又存在着千丝万缕的联系，二者协同作用，共同促进肿瘤的演进和转移，在乳腺肿瘤中检测二者的表达具有重要意义，对Galectin3、OPN作用机制的进一步研究也可能使其成为一种新的可靠的IDC诊断标记物和IDC患者个体化治疗的靶向蛋白。

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