细胞凋亡相关基因Bcl2、Bax、Bak mRNA在子痫前期患者胎盘组织中的表达及其意义

　　　　 作者：王欣　王小青　刘晓梅　花向东

【摘要】 目的：探讨细胞凋亡相关基因Bcl2、Bax、Bak mRNA在子痫前期患者胎盘组织中的表达及其意义。方法：采用RTPCR方法测定36例正常足月妊娠妇女（A组）、24例轻度子痫前期患者（B组）和17例重度子痫前期患者（C组）胎盘组织中Bcl2、Bax、Bak mRNA表达水平。结果：（1）与B组（1.563±0.398）和A组（1.723±0.300）相比，C组Bcl2 mRNA表达水平（0.642±0.288）明显降低（q=12.41，P＜0.05；q=15.69，P＜0.05），B组与A组之间无明显差异（q=2.6，P＞0.05）。（2）与A组（0.347±0.191）相比，B、C组BaxmRNA表达水平（分别为0.745±0.260、1.335±0.308）明显升高（q=8.79，P＜0.05；q=19.54，P＜0.05），C组较B组升高更为显著（q=10.83，P＜0.05）。（3）与B组（0.875±0.322）和A组（0.809±0.381）相比，C组BakmRNA表达水平（2.197±0.546）明显升高（q=14.52，P＜0.05；q=16.42，P＜0.05），B组与A组之间无明显差异（q=0.87，P＞0.05）。结论：细胞凋亡相关基因Bcl2、Bax、Bak mRNA在子痫前期患者胎盘组织中的差异表达参与了子痫前期的病理生理过程。

【关键词】 细胞凋亡　Bcl2　 Bax　 Bak　子痫前期　胎盘
　　
　 Abstract：Objectives To investigate the expression and significance of apoptotic correlated gene Bcl2，Bax and Bak mRNA in preeclampsia placenta. Methods The levels of Bcl2，Bax and Bak mRNA expression in placenta of 36 healthy term pregnant women (group A)，24 patient with mild preeclampsia (group B)，and 17 patients with severe preeclampsia (group C) were examined with RTPCR. Results (1)Expression of Bcl2 mRNA in placental tissues in group C (0.642±0.288) was significantly lower than that in group B (1.563±0.398) and group A (1.723±0.300) (q=12.41，P＜0.05;q=15.69，P＜0.05)，while no statistical differences were observed between group B and group A (q=2.6，P&>0.05).（2）Expression of Bax mRNA in placental tissues in group B (0.745±0.260) and group C (1.335±0.308) were significantly higher than that in group A (0.347±0.191) (q=8.79，P＜0.05;q=19.54，P＜0.05)，and the level of Bax mRNA in placental tissues in group C was higher than that in group B (q=10.83，P＜0.05).(3)Expression of Bak mRNA in placental tissues in group C (2.197±0.546) was significantly higher than that in group B (0.875±0.322) and group A (0.809±0.381) (q=14.52，P＜0.05;q=16.42，P＜0.05)，while no statistical differences were observed between group B and group A (q=0.87，P&>0.05). Conclusion The differential expression of apoptotic correlated gene Bcl2，Bax and Bak mRNA in preeclampsia placenta play an important role in the physiological and pathological process of preeclampsia.

　 Key words：apoptosis； Bcl2; Bax; Bak; preeclampsia; placenta

　　　子痫前期是妊娠期特发性疾病，是造成围产期孕妇和围产儿死亡的主要原因，也是围产医学所要解决的重要课题，其病因至今尚未明确。近年研究发现，胎盘细胞凋亡在子痫前期的发病中起着重要作用，细胞凋亡失衡可能为子痫前期患病原因之一［1］。本研究对子痫前期患者胎盘组织中Bcl2、Bax、Bak等凋亡相关基因mRNA表达水平进行了检测，以探讨子痫前期患者胎盘组织中细胞凋亡相关基因表达的变化及其在子痫前期病理生理过程中的意义。

　　　1 资料与方法

　 1.1 一般资料

　 选择2005年12月至2006年12月在我院住院行剖宫产术的子痫前期患者41例，其中重度子痫前期患者17例（设为C组），平均年龄（28.35±3.82）岁，平均孕龄（36.45±2.49）周，新生儿平均体重（2561±656）g；轻度子痫前期患者24例（设为B组），平均年龄（29.04±5.19）岁，平均孕龄（37.51±1.91）周，新生儿平均体重（2796±620）g。选取同期无妊娠合并症及并发症的剖宫产产妇36例为对照组（A组），平均年龄（28.78±4.02）岁，平均孕龄（39.01±0.98）周，新生儿平均体重（3379±385）g。子痫前期的诊断及分类标准参照文献［2］，患者均排除心、肝、肾及内分泌疾病史，无其他妊娠合并症及并发症。

　 1.2 方法

　　1.2.1 标本采集

　　受检者均在剖宫产术中胎盘娩出后，在无菌状态下取胎盘母体面正中组织约1 cm×1 cm×1 cm大小，用生理盐水漂洗去掉血液，立即置于液氮中保存。

　　1.2.2 RTPCR技术检测胎盘组织Bcl2、Bax、Bak mRNA表达

　　Bcl2、Bax、Bak基因编号分别为NM_000657.2、NM_004324.3、NM_001188.3，采用Trizol一步法提取总RNA（Trizol试剂，Invitrogen Inc.），设βactin作为内参物，进行总RNA定量和纯度分析（Beckman DU600紫外分光光度计）。RT反应（试剂为美国Promege Inc.与Allele Biotech && Pharmaceuticals Inc.产品）按说明书操作。Bcl2：上游引物5′TGCGACTCCTGATTCATTG3′，下游引物5′TGGTTATCGTACCCTGTTCTC3′，扩增产物长度465 bp，退火温度60℃；Bax：上游引物5′TTTGCTTCAGGGTTTCATCCA3′，下游引物5′GAGCTAGGGTCAGAGGGTCATC3′，扩增产物长度731 bp，退火温度62℃；Bak：上游引物5′GGATTGGTGGGTCTATGTTC3′，下游引物5′TCTGGGATTCCTAGTGGTGT3′，扩增产物长度545 bp，退火温度58℃。PCR反应条件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，28个循环。取5 μl PCR产物，2.0％琼脂糖/溴化乙锭凝胶电泳。UVP凝胶密度扫描仪及其分析软件（UVP Inc.）进行半定量分析。

　　1.3 统计学处理

　　　采用Excel软件进行统计学分析，数据以x-±s表示，多组间均数比较采用方差分析F检验，进一步组间两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

　 2 结 果

　　Bcl2、Bax、Bak mRNA在子痫前期患者胎盘组织中的表达见表1。表1 各组Bcl2、Bax、Bak mRNA相对表达量（略）

　　　3 讨 论

　 胎盘是妊娠过程中发展起来的联系母体与胎儿的物质交换器官，对妊娠的维持有着重要作用，胎盘细胞增殖、凋亡的平衡是胎盘发挥作用的基础，细胞凋亡失调将导致病理妊娠。子痫前期的基本病理变化是全身小血管痉挛，各脏器灌流减少，随着妊娠的继续，病情有加重的趋势；而妊娠结束、胎盘娩出后，病情可以迅速得到控制。多项研究发现［3］，妊娠高血压患者胎盘滋养细胞、合体滋养细胞、蜕膜细胞的凋亡数量均明显高于正常妊娠者，说明细胞凋亡参与了胎盘的生长发育与代谢。

　 细胞凋亡过程十分复杂，涉及不同基因及其产物的调控和细胞因子的调节。Bcl2家族蛋白位于线粒体的上游，对线粒体诱导的细胞凋亡具有重要的调节作用［4］。Bcl2家族成员含有1～4个同源结构域，现已至少发现19个同源物。根据蛋白在细胞凋亡中的功能可将Bcl2基因家族分为两类：一类是抗凋亡的，如Bcl2、Bclxl、Bclw、Mcl1；一类是促进凋亡的，如Bax、Bak、Bad、Bid、Bim［5］。其中Bcl2是一种抑制细胞凋亡的线粒体膜蛋白，对凋亡具有直接调节作用，其C末端含有1个由19个氨基酸组成的疏水跨膜区，作为1个信号锚定序列，负责定位和插入到线粒体外膜，抑制细胞凋亡，其表达可对抗细胞内外的氧自由基对细胞的毒害与损伤作用。其在细胞内表达增强可以抑制或防止多种因素或因子诱发的细胞凋亡，延长细胞的寿命，是许多生理或病理凋亡的关键性调节因子［6］。Bax是最早发现的促凋亡因子，Bax分子结构中含有类似于抗凋亡成员的疏水C端，然而亚细胞分级和免疫组织化学实验均表明Bax在正常细胞中主要定位于细胞浆。虽然在线粒体上也发现有部分Bax存在，但Bax分子并非插入线粒体外膜内而是附着于线粒体表面［7］。而Bak是迄今发现的仅有的一个定位于线粒体的促凋亡蛋白质成员。但是，Bak在正常细胞中并不表现促凋亡活性，推测可能是在线粒体外膜中的Bak与Bclxl结合而被抑制的结果。细胞受到凋亡刺激后，Bak分子N端暴露并发生构象变化，Bak得以与Bclxl分离，释放出来的Bak仍继续留在线粒体外膜内，并与裂解激活的Bid结合，结果导致Bak激活或Bak寡聚化并形成Cyt c的输出通道，从而引起细胞凋亡［89］。

　 Bax和Bcl2基因是一对重要的细胞凋亡调控基因，Bcl2表达高时，与Bax形成异二聚体抑制凋亡，Bax表达高时，则自身形成同源二聚体，促进凋亡［10］。有研究表明，一切促进或抑制凋亡基因对细胞凋亡的影响最终归结为Bax与Bcl2比值的改变［11］。本研究结果显示，子痫前期患者胎盘组织中Bax表达随着病情的变化呈增高趋势，Bcl2则呈下降趋势，Bax/Bcl2值显著增高，这和既往研究结果一致。Bax/Bcl2值增高抑制细胞增生，促进细胞凋亡，反映了病情的严重程度。妊娠期高血压疾病胎盘组织中易形成Bax/Bax二聚体，加速细胞凋亡，这表明Bax与Bcl2参与胎盘的凋亡调节，与妊娠期高血压疾病有密切关联。

　　　Bax和Bak能被只具有BH3结构域的蛋白活化形式（tBid）所激活，激活后能够在线粒体外膜形成同源聚合物，导致线粒体膜损伤，细胞色素C释放，激活胱冬肽酶，诱导细胞凋亡，这其中Bax很可能是决定凋亡发生与否的必要因素，而Bak则是凋亡的控制因素［12］。本研究结果显示，Bak mRNA在重度子痫前期患者胎盘组织中表达水平明显升高，而在轻度子痫前期组无明显改变，提示Bak在子痫前期的不同阶段中同样具有重要作用。

　 子痫前期是一个复杂的过程，影响因素众多，3种凋亡基因在子痫前期不同阶段的差异表达，提示不同的凋亡基因可能在子痫前期发展的不同阶段发挥相应的生理和病理学效应。本研究为进一步探讨凋亡基因介导的线粒体损伤提供了实验依据。

参考文献

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