基于SP细胞分选法初步鉴定卵巢癌干细胞表面标志

　　　　作者：张弦　蒋翠莲　王宝偲　刘蔷　左鹏飞　赵枫姝　窦骏

【摘要】 目的： 基于侧群（SP）细胞分选方法，初步鉴定卵巢癌干细胞（CSC) 表面标志，为临床靶向治疗卵巢癌提供靶分子。方法： 检测、分离卵巢癌细胞株A2780中的SP细胞，并对SP与NonSP细胞作细胞生物学鉴定，包括克隆形成能力、致瘤能力、耐药性、定量ATP结合框蛋白家族G2蛋白 (ABCG2)检测等；进一步用免疫磁选方法筛出ABCG2+及ABCG2-细胞，同样作上述细胞生物学鉴定，探讨ABCG2分子能否作为卵巢CSC的表面标志。结果： 卵巢癌A2780细胞株中的SP细胞在体外强克隆形成能力、裸鼠体内的高致瘤性、对化疗药物长春新碱较强耐受性及高表达ABCG2分子等生物学特性基本符合CSC的特征。ABCG2＋细胞的克隆增殖能力略强于ABCG2-细胞；ABCG2+细胞的耐药性与SP细胞的耐药性一致。结论： A2780细胞株中的SP细胞基本符合CSC的生物学特征，其高表达的ABCG2分子参与维持SP细胞表型，特别是多药耐药性。ABCG2分子可作为靶向治疗CSC的靶分子，逆转肿瘤的多药耐药性。

【关键词】 侧群细胞　卵巢癌　癌干细胞　ABCG2分子　靶向治疗
　　
　 Abstract： Objective To explore a target molecule for the clinical targeted therapy of ovarian cancer. Methods The SP cells and non SP cells were isolated respectively from the human ovarian cell 2780 strain by fluorescence activated cell sorting (FACS) and their biological characteristics were identified by analysis of their ability to form colonies in common media， tumorigenicity in Balb/c nude mice， and of their resistance to chemotherapeutic agents vinblastin. The expression of ABCG2 was detected with realtime quantitative RTPCR (qRTPCR). The specific ABCG2 phenotype cells were further isolated from the ovarian cell A2780 strain for the same identification as above by the monoantibody labeled with immune magnetic beads by magnetic activated cell sorting system. Results The SP cells proliferative potency， clone formation ability in the common media， the tumorigenicity in Balb/c nude mice， and resistance to vinblastin in vitro were basically coincident with characteristics of cancer stem cells（CSC）. The ABCG2＋cells proliferative potency and resistance to vinblastin in vitro were higher than those of the ABCG2-cells. Conclusion The SP cells in the ovarian cell 2780 strain possess the traits of ovarial CSC and expressed ABCG2 molecule maintains the SP cells phenotype， especially in multidrug resistance. The ABCG2 molecule may be responsible for target molecule of the targeted therapy of ovarian cancer and for inversion of multidrug resistance in ovarian cancer.

　 Key words：side population cells; ovarian cancer; cancer stem cells; ABCG2 molecule; target therapy
　　
　　卵巢癌是女性生殖器官常见肿瘤，发病率在妇科恶性肿瘤中列居第三，但其致死率却为各类妇科肿瘤之首［1］，因此，探索治疗卵巢癌的新途径，已成为进一步提高卵巢癌患者生存率的关键。随着干细胞(stem cells， SC)研究的深入，人们发现肿瘤是一种SC疾病。许多证据表明，大多数的肿瘤组织中存在着具有SC特征的“起始肿瘤细胞”(tumor initial cells， TIC)，称为癌干细胞(cancer stem cells， CSC)，其是肿瘤增长、耐药及复发的根源［2］。分离与鉴定是CSC研究的第一步，由于CSC缺乏已知的统一特异性标记，分离和鉴定成为CSC研究的难点。本研究主要通过侧群（side population，SP）细胞分选结合ＡＴＰ结合框蛋白家族Ｇ2蛋白（ＡＴＰbinding cassette G2， ABCG2)等方法初步研究卵巢CSC，其中SP细胞是指可将荧光染料Hoechst33342泵出细胞外、表现弱荧光信号的细胞群，占总体细胞的很少部分［3］。在缺乏显著CSC分子标记的情况下，SP细胞的筛选分析可以作为CSC鉴定的一种实用而简易的重要方法［4］。

　 1 材料与方法

　 1.1 动物及细胞株

　 Balb/c系的4～6周雌性裸鼠，购于上海动物模式中心。人卵巢癌细胞株A2780购于南京中医药大学，于加10%新生小牛血清的1640培养液中，在37 ℃、5%CO2环境下培养。

　　　1.2 实验方法

　　1.2.1 A2780细胞中SP/NonSP细胞流式检测和分选实验

　 取对数生长期的单层培养细胞，制成单个细胞悬液，实验组加入Hoechst33342至终浓度5 μg·ml-1，对照组再加入Verapamil至终浓度50 μg·ml-1，37 ℃水浴90 min，重悬于冰冷的含2%小牛血清的PBS中，上流式细胞分选仪(fluorescenceactivated cell sorting， FACS)检测。以355 nm UV激发光源、610 nm双色短通反射滤镜、450 nm和675 nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号，将细胞中荧光信号分为两个部分，以Hoechst 红点为X轴，Hoechst 蓝点为Y轴作二维散点图，将低Hoechst 红点及低Hoechst 蓝点且对照组缺失的区域设定为SP细胞的“门” ［5］，将只加入Hoechst33342的实验组细胞分选出SP细胞及NonSP细胞。

　　1.2.2 克隆（集落）形成实验

　　1.2.2.1 平皿克隆形成实验

　　将分选的SP及NonSP细胞悬液按每皿含100个细胞接种于培养皿中。在37 ℃、5%CO2环境下培养。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时终止培养，甲醇固定，姬姆萨染液染色后计数，用肉眼直接计数克隆数，或在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。按公式“克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%”计算克隆形成率。

　　1.2.2.2 软琼脂克隆形成实验

　　24孔培养板中每孔分别浇入含0.5%低熔点琼脂的底层琼脂0.8 ml以及含0.3%琼脂和一定细胞密度（分别含有100个细胞）的上层琼脂0.8 ml，置于室温使琼脂凝固。在37 ℃、5%CO2及饱和湿度环境下静止培养。第10天镜下计数直径大于75 μm或含50个细胞以上的克隆，并计算克隆形成率。

　　1.2.3 裸鼠体内致瘤实验

　　1.2.3.1 SP/NonSP细胞裸鼠体内致瘤实验

　　4～6周龄Balb/c系雌裸鼠随机分为SP细胞组及NonSP细胞组，每组3只裸鼠，背部皮下注射对应的细胞悬液100 μl 5×104个细胞，随后监测各组小鼠肿瘤生长时间。

　　1.2.3.2 ABCG2+/ABCG2-细胞裸鼠体内致瘤实验

　　4～6周龄Balb/c系雌性裸鼠随机分为ABCG2+细胞组及ABCG2-细胞组，每组6只，背部皮下注射对应的细胞悬液100 μl 5×104个细胞，随后监测各组小鼠肿瘤生长时间。

　　1.2.4 MTT法检测SP和NonSP细胞对长春新碱耐受性

　 取分选得到的SP/NonSP细胞接种于96孔板，实验组加入浓度为10 μg·ml-1的长春新碱溶液10 μl至终浓度0.5 μg·ml-1， 培养72 h后 MTT法检测细胞的存活率。

　　1.2.5 实时荧光定量PCR检测SP/NonSP细胞ABCG2基因表达

　　　检测ABCG2：PCR上游引物5′GGCAGATGCCTT
CTTCGTTATGATG3′，下游引物5′TGGTTGTGAGATT
GACCAACAGACC3′。 检测βactin：PCR上游引物5′GGACTTCGAGCAAGAGATGG3′，下游引物5′AGC
ACTGTGTTGGCGTACAG3′。

　 反应体系置入ABI 7300 RealTime PCR仪按如下程序进行PCR扩增：94 ℃预变性4 min，进入3步循环(94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃35 s，共45个循环)，在3步循环中的每个反应循环结束时，RealTime PCR仪记录SYBRGreenⅠ释放的荧光。以逆转录合成样品的cDNA产物作为模板，按相同的反应体系进行目的基因ABCG2和内参βactin的Real TimePCR扩增反应，并以ddh3O为模板设阴性对照，电脑采集每个循环的数值。使用7300 System SDS Software进行数据分析和统计学处理。

　　1.2.6 利用免疫磁选技术分离获取ABCG2+表型细胞

　 制备A2780单细胞悬液，每107 个细胞加20 μl一抗，混匀后6～12 ℃孵育10～15 min。每107个细胞再加20 μl磁珠二抗，混匀后6～12 ℃孵育15 min或冰育20～30 min。然后用1000 μl缓冲液洗涤细胞两次以去除多余的抗体，每107个细胞重悬于100 μl Buffer中过柱，在磁场力的作用下，未能标记上ABCG2分子抗体的细胞不会在磁场中停留，用1500 μl Buffer冲洗柱子。收集阴性细胞培养，移开分离柱收集阳性细胞。

　　1.2.7 ABCG2+/ABCG2-/经抗体孵育ABCG2+细胞对长春新碱耐受性

　 取分选得到的ABCG2+/ABCG2-，接种于96孔板，实验组加入浓度为10 μg·ml-1的长春新碱溶液10 μl至终浓度0.5 μg·ml-1，经抗体孵育ABCG2+细胞组同时加入ABCG2单抗2 μl·孔-1，培养72 h后MTT法检测细胞的存活率。

　　　2 结 果

　　　2.1 SP/NonSP细胞流式检测、分选及细胞生物学功能的鉴定

　　FACS检测出A2780 细胞中的SP细胞比例约为2.6%（B值2.7%减去A值0.1%，图1）。将图1B中门区域的细胞分选下来，分选所得的SP/NonSP细胞分别行相关的细胞生物学鉴定。克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一［6］，常见的方法有平板克隆（图2A）和软琼脂克隆（图2B）形成实验。本实验显示，SP细胞的平板克隆率及软琼脂克隆率均明显高于NonSP细胞（图2C），两者差异有统计学意义（P＜0.01）。在软琼脂克隆实验中SP细胞多为克隆球形式存在，而NonSP细胞则很难形成克隆球，多以散在细胞存在（图2B）。裸鼠体内致瘤实验中，2周内SP细胞组2只裸鼠长出了肿瘤(2/3)，NonSP细胞组在8周后仍无肿瘤生长（0/3），余鼠在10周后均无肿瘤生长(图2D)。 SP/NonSP细胞对长春新碱耐受性实验中，0.5 μg·ml-1浓度长春新碱作用于这两种细胞72 h，用MTT法检测发现，对SP细胞的生长抑制作用不明显，其存活率约为81%，而对NonSP细胞的抑制作用明显，其存活率仅为37%，差异有统计学意义（P＜0.01，图3）。用定量RTPCR检测SP细胞与NonSP细胞ABCG2表达量，结果显示，SP细胞约是NonSP细胞的5.8倍（图4）。

　　2.2 A2780细胞中ABCG2+/ABCG2-细胞生物学鉴定

　　首先利用免疫磁珠分离技术获取A2780细胞中的ABCG2+表型细胞，1×107 个A2780 细胞可得到约2×105个ABCG2+细胞，即A2780细胞中ABCG2+表型细胞占2%左右，其含量与SP细胞的比例相似。将分选所得的ABCG2+/ABCG2-细胞行相关的细胞生物学特性鉴定，在细胞体外克隆形成实验中，ABCG2+细胞在平板克隆率及软琼脂克隆率均略高于ABCG2-细胞（图5），但差异无统计学意义（P＞0.05)。在裸鼠体内致瘤实验中， ABCG2+细胞组在细胞接种后5周时6只裸鼠中2只长出了肉眼可见的肿瘤(2/6)， ABCG2-细胞组在细胞接种后第5周时6只裸鼠中1只长出了肉眼可见的肿瘤(1/6)，其余鼠在接种后10周始终没有肿瘤的生长，两组间差异无统计学意义。分别将A2780细胞株分选的ABCG2+/ABCG2-、ABCG2+加抗体孵育的各组细胞进行长春新碱耐受性比较，发现药物对ABCG2+细胞的生长抑制不明显，其细胞存活率约为79%，而对ABCG2-细胞组的生长抑制明显，其细胞存活率仅为35%，对ABCG2+细胞且加入抗ABCG2抗体共同培养组的细胞生长抑制也很明显，其细胞存活率约为38%，较未加抗体组明显下降，反映了ABCG2分子可能介导了细胞对药物的耐受（图6）。

　　3 讨 论

　　　分离与鉴定是CSC研究的第一步，由于多数CSC缺乏明确的特异性标记，分离和鉴定成为CSC研究的难点。目前，从形态学上很难区分CSC与肿瘤细胞间的差异，只能用功能学方法即从其自我更新能力和分化潜力来鉴定CSC。分离CSC主要有：SP细胞分选、无血清培养富集干细胞及通过CSC表面特异性标志筛选3种方法［7］。其中SP细胞是1996年Goodell等［3］在用Hoechst33342染色法研究全骨髓时，发现有极少一部分细胞可以将进入细胞核的荧光染料排出胞外，在荧光显微镜下观察或流式细胞仪检测时表现为不着色，他们将这类细胞命名为“SP”细胞，将这种表型命名为“SP表型”，该表型细胞还表达干细胞标志 Sca1+ Linneg/low。现发现SP细胞广泛存在于多种生物的多种正常组织中，并同时存在于多种肿瘤细胞系及肿瘤组织中［89］。随着对SP细胞研究的深入，发现SP细胞的功能与正常干细胞相似，如SP细胞可发生不对称分裂、进行自我更新等［10］。多项研究表明，部分肿瘤(乳腺癌、前列腺癌、脑胶质瘤等)中SP细胞具有CSC特性，即表达干细胞相关表面标志，具有自我更新、强致瘤能力和高表达转运蛋白ABCG2［11］等。研究显示，在卵巢癌细胞中存在致瘤性较强的SP细胞［1213］，因此，我们利用SP细胞与干细胞、CSC具有许多共性的特点来探讨SP细胞分选法能否作为卵巢CSC分离鉴定的有效方法，并以此为基础初步研究卵巢CSC表面特异性标志。本研究的结果显示，卵巢癌A2780细胞株中的确有SP细胞存在，虽然仅占很少部分（约2.6%），但其较强的克隆形成能力、致瘤能力、耐药性及ABCG2基因表达显示，SP细胞的生物学特性基本符合CSC 的特征。本研究使用实时荧光定量PCR检测结果显示，SP细胞中ABCG2分子的表达量明显高于NonSP细胞，因此我们推测ABCG2分子可能是卵巢CSC表面的一个特异性分子标志。ABCG2分子属ATP结合框转运体(ATPbinding cassette transporter， ABC)家族所介导的肿瘤细胞多重耐药分子家族中的一种，属跨膜药物转运蛋白，是抗肿瘤药物难以发挥效应的关键耐药蛋白［1417］。本研究发现，ABCG2+细胞的体外克隆能力及裸鼠体内致瘤能力仅略高于ABCG2-细胞，差异无统计学意义，说明ABCG2分子的高表达与卵巢CSC的强细胞增殖能力无明显关系，维持卵巢CSC高增殖能力的特性可能还有其它分子参与，如其它干细胞标志等还需进一步研究。而ABCG2+细胞对化疗药物的耐受能力则明显高于ABCG2-细胞，且ABCG2+细胞加入ABCG2单克隆抗体孵育后能使ABCG2+细胞对化疗药物的耐受性明显降低，说明ABCG2分子是参与维持卵巢癌细胞多药耐药性的一个主要分子标志。

　　　综上所述，卵巢癌A2780细胞株中的SP细胞符合CSC的特性，分离SP细胞能够富集卵巢CSC，这为下一步研究CSC的特异性标记奠定了基础，并为开展对卵巢CSC药物防治，尤其是为有效的靶向治疗等研究提供了科学的实验依据。

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