纳米免疫磁珠联合RTnestPCR法检测胰腺癌外周血微转移的敏感度及特异性

　　　　　　 作者：胡亮，周家华，余泽前，陶可涛

【摘要】 目的： 通过胰腺癌外周血微转移模型，探讨纳米免疫磁珠联合RTnestPCR检测微转移的敏感度及特异性。方法： 将胰腺癌细胞PANC1稀释分别加入到正常人外周血单核细胞中，再按比例加入Fcλ非特异性受体阻断剂以及上皮细胞EPCAM抗体，4 ℃下混匀孵育30 min，经分选柱阳性分选后提取RNA，RTnestPCR法检测肿瘤基因人端粒酶亚单位(hTERT)和癌胚抗原(CEA)。结果： 联合纳米免疫磁珠和RTnestPCR，平均1×107外周血单核细胞可以检测到1个肿瘤细胞。10例良性疾病对照组均未见表达。结论： 免疫磁珠联合RTnestPCR是敏感度及特异性都较高的检测微转移的方法，可显著提高肿瘤微转移的早期检测率。

【关键词】 胰腺癌; 微转移; 免疫磁珠; 逆转录巢式聚合酶链反应

胰腺癌的发病率有逐年升高的趋势，90%的患者在诊断后1年内死亡。5年生存率仅为1%～3%。虽然切除原发肿瘤和术后放化疗可以延长肿瘤患者的生存率，但是5年生存率仍较低，在4%左右，即使患者行根治性手术切除，80%的患者在2年内出现复发[1]。研究发现，这与微转移有关[2]。

　　检测肿瘤微转移的标本有淋巴结、外周血、骨髓、门静脉血、腹腔冲洗液、腹膜、胸腔冲洗液、胰液、粪便等。外周血具有可以重复抽取、患者更乐于接受、创伤小的优点，所以临床上可以用来检测微转移，以此监测患者辅助治疗的效果[3]。

　　本实验模拟胰腺癌外周血微转移，利用纳米免疫磁珠分离外周血肿瘤细胞，再应用RTnestPCR法检测人端粒酶亚单位(hTERT)、癌胚抗原(CEA)两种肿瘤标志物确定外周循环微转移存在，探讨纳米免疫磁珠联合RTnestPCR法检测微转移的敏感度及特异性。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料及试剂

　　上皮细胞特异性的抗人EPCAM 纳米免疫磁珠(50 nm)(德国Miltenyi公司生产)，Fcλ非特异性受体阻断剂(德国Miltenyi公司生产)，Mini磁场(德国Miltenyi公司生产)，分选柱(德国Miltenyi公司生产)。淋巴细胞分离液(天津中国科学院生产)，RTPCR试剂盒(日本Toyobo公司生产)，RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司生产)。引物设计软件Primer Premier 5.0。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2 体外培养胰腺癌细胞PANC1

　　取对数生长期的PANC1消化并捶打成单个细胞，离心后分散悬浮于PBS中，制成细胞悬液。

　　1.3 单核细胞分离

　　将健康人第1管外周血约5 ml弃去(防止上皮细胞污染)，取第2管外周静脉血10 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝后用淋巴细胞分离液获取外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。

　　1.4 参照模型的建立

　　人胰腺癌细胞PANC1用磷酸盐缓冲液稀释，然后加入至健康人单核细胞中，使肿瘤细胞与PBMC比例平均分别为104∶1×107、103∶1×107、102∶1×107、101∶1×107、100∶1×107、100∶2×107 。

　　1.5 良性疾病对照组

　　共10例良性疾病患者，其中6例为胆囊结石，3例胆管结石，1例为脾异位。

　　1.6 免疫磁珠分离

　　上述获得的PBMC，按照每5×107单核细胞比例加入Fcλ非特异性受体阻断剂100 μl，4 ℃下混匀30 min;按相同比例加入上皮细胞特异性的抗人EPCAM 免疫磁珠 ， 4 ℃下混匀30 min。加入1 ml BSA洗涤2次去除多余抗体。200 μl BSA重新悬浮。将分选柱放入磁场，先用500 μl BSA湿润柱子，然后将200 μl细胞悬浮液加入柱子，每次使用500 μl BSA冲洗柱子，冲洗3次，将分选柱移出磁场，加入1 ml BSA，加压冲洗柱子，得到分选出的肿瘤细胞，800 r·min-1离心。

　　1.7 RTnestPCR

　　1.7.1 RNA提取及cDNA合成 加入1 ml Trizol，放置5 min，加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置3 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min，将上层无色水相移到新离心管中，加入等体积异丙醇，混匀室温放置30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，去上清，加入1 ml 75%乙醇洗涤。4 ℃ 5 000 r·min-1离心3 min倒出液体，室温放置晾干，加入适量RNasefree双蒸水吹打混匀。按照RTPCR试剂盒要求合成cDNA，放置-20 ℃备用。

　　1.7.2 nestPCR CEA的引物序列:外引物5′TCTG

　　GAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG3′(正义链)，5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC3′(反义链)，扩增产物大小为160 bp;内引物5′TGTAGCTG

　　TTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC3′(正义链)，5′GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG3′(反义链)，产物大小为131 bp。HTERT的引物序列为：外引物5′TGGTGGATGATTTCTTGTTGG3′(正义链)，5′GCAGG

　　AGGATCTTGTAGATGTTG3′(反义链)，产物大小423 bp;内引物5′CCCTGAATGAGGCCAGCAGT3′(正义链)，5′CTCCATGTCGCCGTAGCACA3′(反义链)，产物大小161 bp。第1轮扩增: 95 ℃预变性5 min;然后95 ℃变性45 s，50 ℃(hTERT)/55 ℃(CEA)退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环;最后72 ℃延伸5 min。第2轮扩增:95 ℃预变性5 min;然后95 ℃变性45 s，57 ℃(hTERT)/53 ℃(CEA)退火45s，72 ℃延伸45 s，35个循环;最后72 ℃延伸5 min。以上步骤重复2次。

　　1.8 PCR产物凝胶电泳

　　上述所得PCR产物均以2%琼脂糖凝胶电泳检测，用100 bp梯度 DNA ladder作为相对分子质量标志。

　　2 结 果

　　在6组肿瘤细胞与PBMC不同比例组(104∶1×107、103∶1×107、102∶1×107、101∶1×107、100∶1×107、100∶2×107)中，在1～5组均检测到CEA、hTERT表达(图1)。敏感度可以达到平均1×107外周血单核细胞可以检测到1个肿瘤细胞。10例良性疾病对照组中均无表达。

　　3 讨 论

　　微转移的检测方法主要有免疫组化染色、流式细胞技术、聚合酶链反应、逆转录聚合酶链式反应、实时定量RTPCR技术、利用上皮肿瘤细胞大小分离技术等[4]， 这些方法各具优缺点，目前应用最广泛的是免疫组化染色和分子生物学方法。免疫组化方法虽然可以直观地检测到微转移的存在与否，但需要选择应用特异性及敏感度较高抗体等原因，导致敏感度低于分子生物学方法。分子生物学方法具有较高的敏感度，也正是因为其具有较高敏感度，导致了假阳性产生[5]。所以，目前研究的主要重点在于找到一种能够具有较高灵敏度及特异性的微转移检测方法。

　　肿瘤患者外周血循环中肿瘤细胞数量与肿瘤分期之间存在一定关系，肿瘤分期越高，其循环中肿瘤细胞数量越多[56]。所以在检测肿瘤患者外周血循环中肿瘤细胞存在与否时，检测的灵敏度尤为重要。对于外周循环中播散的肿瘤细胞较少的肿瘤患者，如果采用灵敏度较高的检测方法，就可以早期检测到微转移的存在。

　　应用纳米免疫磁珠联合RTnestPCR法，既保证了检测的特异性，又提高检测的灵敏度。免疫磁珠表面附着有上皮细胞免疫分子(EPCAM)抗体，此种抗体可识别34 000、39 000两种糖蛋白，它们表达于大多数正常和瘤组织上皮细胞的膜表面。包被有抗体的磁珠与上皮细胞表面的抗原进行免疫化学结合，随后运用磁场将这些细胞从样品中分离出来。这样既保证了分离得到的肿瘤细胞的纯度，又减少了血细胞的污染，从而提高了微转移检测的特异性。

　　nestPCR的优点在于，如果第1次扩增产生了错误片断，则第2次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低[7]。因此，nestPCR的扩增特异性非常高。而且由于对第1次PCR的产物进行了第2次PCR扩增，所以敏感度较高。本实验最初应用免疫磁珠普通的PCR方法检测率较低，仅达到104个单核细胞中检测到1个肿瘤细胞。考虑以下原因：(1)免疫磁珠的高特异性导致富集到的肿瘤细胞数量较少，肿瘤细胞纯度较高导致提取总RNA量较少，PCR产物量从而较少。(2)另外引物设计方面也有一定关系。

　　本实验中10名良性疾病患者均未表达hTERT及CEA 2个肿瘤指标表达，且胰腺癌细胞株PANC1均表达这2个肿瘤指标，所以检测到标本表达CEA及hTERT，意味着检测到了有活力的肿瘤细胞，就可以确定微转移的存在[8]。免疫组化方法检测外周血微转移的敏感度可以达到在105～106个单核细胞中可以检测到1个肿瘤细胞[9]。而免疫磁珠联合RTPCR方法检测微转移的敏感度可以达到在107个单核细胞中检测到1个肿瘤细胞，可见其敏感度明显高于免疫组化法。 肿瘤细胞存在异质性，所以联合检测多个肿瘤基因，可以提高微转移检测的特异性及敏感度，提高检测阳性率，降低检测的假阴性率。本实验对比单独应用RTPCR法及免疫磁珠联合RTPCR法检测外周循环肿瘤细胞播散模型的敏感度，发现单独运用RTPCR法敏感度只能够达到1个肿瘤细胞/1×106 个PBMC，但应用免疫磁珠联合RTPCR法敏感度达到1个肿瘤细胞/1×107PBMC 。

参考文献

　　[1]THORBAN S，RODER J D，SIEWERT J R.Detection of micrometastasis in bone marrow of pancreatic cancer patients[J].Ann Oncol，1999，10(Suppl 4):111113.

　　[2]ZIPPELIUS A，PANTEL K.RTPCRbased detection of occult disseminated tumor cells in peripheral blood and bone marrow of patients with solid tumors. an overview[J].Ann N Y Acade Sci，2000，906:110123.

　　[3]CAMARA O，RENGSBERGER M，EGBE A，et al.The relevance of circulating epithelial tumour cells (CETC) for therapy monitoring during neoadjuvant (primary systemic) chemotherapy in breast cancer [J].Ann Oncol，2007，18(9):14841492.

　　[4]MULLER V，PANTEL K.Bone marrow micrometastases and circulating tumor cells:current aspects and future perspectives[J].Breast Cancer Res，2004，6(6):258261.

　　[5]BENOY I H，ElST H，PHILIPS M，et al.Realtime RTPCR detection of disseminated tumour cells in bone marrow has superior prognostic significance in comparison with circulating tumour cells in patients with breast cancer[J].Br J Cancer，2006，94(5):672680.

　　[6]KURAHARA H，TAKAO S，MAEMURA K，et al.Impact of lymph node micrometastasis in patients with pancreatic head cancer[J].World J Surg，2007，31(3):483490.

　　[7]PATERLINIBRECHOT P，BENALI N L.Circulating tumour cells (CTC) detection:clinical impact and future directions[J].Cancer Lett，2007，253(2):180204.

　　[8]FRYZEK J P，GARABRANT D H，SCHENK M，et al.The association between selected risk factors for pancreatic cancer and the expression of p53 and Kras codon 12 mutations[J].Int J Gastrointest Cancer，2006，37(4):139145.

　　[9]MATSUNAMI K，NAKAMURA T，OGUMA H，et al.Detection of bone marrow micrometastasis in gastric cancer patients by immunomagnetic separation[J].Ann Surg Oncol，2003，10(2):171175.