血流剪切应力信号转导与动脉粥样硬化的关系

　　　　　　 作者：武春艳，刘录山，姜志胜

【关键词】 动脉粥样硬化;剪切应力;信号转导;内皮细胞

　　1 内皮的结构与功能

　　血管内皮是位于血管壁与血液接触的单层细胞，是循环血液与血管壁之间的重要屏障，除了调节血管内外物质交换之外，还有许多重要功能，包括：合成和释放血管活性物质，摄取、转化或灭活血液循环中或者血管局部的生物活性分子，调节血管平滑肌的舒张收缩活动等功能。内皮细胞的功能不仅受生长因子、激素等生化物质的调控，还受到血流机械作用力的影响，后者通过激活相应的信号通路调节血管内皮和平滑肌的结构及功能[1]。

　　2 剪切应力对内皮细胞的作用

　　内皮细胞主要受到血流对其表面沿切线的剪切应力(shear stress)、血液对血管壁静压力(pressure)和血流对血管的牵张力(strain)3种血流机械力的作用，这些作用力可刺激血管活性物质释放和改变基因表达，在调节内皮细胞的形态和功能中起重要作用[2]。

　　在生物力学与动脉粥样硬化的发生机制之间，剪切应力的作用被认为是最重要的因素，其可增加很多激酶的活性，从而调节内皮细胞内许多信号转导蛋白的磷酸化，如丝裂原活化蛋白激酶途径中的蛋白，进而使下游的信号级联放大，包括多种转录因子如激活蛋白复合体1(AP1)、核因子κB(NFкB)、刺激蛋白1(Sp1)和早期生长反应因子1(Egr1)的活化，再作用于相应的顺式作用元件诱导内皮细胞中基因编码血管作用因子、黏附分子、单核细胞趋化因子和生长因子，调节血管的结构和功能[3]。

　　目前生物力学与内皮细胞作用之间存在许多待解决的问题[4]：生物力转导是如何通过内皮细胞转变成生物学反应的，是否存在剪切力受体?机械力感受器和信号通路的最终产生与其他的刺激反应转导系统是否一致?血管内皮是怎样对生理学或病理学剪切应力产生不同反应的?剪切应力受体或易感基因能否作为心血管疾病病理学诊断和治疗方法设计的新靶点?

　　3 剪切应力转导的感受器

　　剪切应力通过内皮细胞上的机械力感受器将机械刺激转化为生化信号，目前已发现多种膜感受器分子，包括整合素家族分子(integrins)、受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)、G蛋白、离子通道等[5]。

　　3.1 内皮细胞膜分子

　　3.1.1 整合素 整合素是普遍存在的α/β异二聚体跨膜糖蛋白，其配体主要为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白，如胶原蛋白、纤粘连蛋白、层粘连蛋白等，通过识别这些ECM蛋白参与细胞和细胞外基质之间的相互作用，在细胞黏附、迁移、生长，血液凝固，炎症反应，白细胞的目标识别和细胞分化等生物学过程中发挥了重要作用[6]。

　　Chatzizisis等[6]研究证实，整合素能够将机械刺激转导为生化信号。Gudi等[7]的研究表明血流诱导的冠状动脉舒张是通过释放NO介导的，能被对抗基质与整合素相互作用的RGD肽阻滞。运用抗整合素B3的抑制性抗体，可减弱血流诱导的血管舒张。整合素与PKC和cSrc家族酪氨酸激酶相关，在人脐静脉内皮细胞利用反义寡核苷酸对抗各种PKC亚型，证实整合素充当黏附受体介导细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的活化依赖PKCα和PKC。此外，当人内皮细胞种植在含纤粘连蛋白基质中时可与整合素B1结合，引起ERK1/2活化，而在含多聚左旋赖氨酸的基质中则无ERK1/2的活化。整合素与血流剪切应力引起的KB抑制蛋白激酶(IKK)、胞外信号调节激酶(ERK)活化及血管内皮生长因子(VEGF)受体胎肝激酶2(FLK2)的磷酸化都有重要联系。另外，血流剪切应力还可引起整合素分子与接头分子Grb、Shc的结合，继而激活下游的信号通路，进一步说明整合素分子在感受和转导血流剪切应力刺激中的重要作用[6]。

　　3.1.2 G蛋白 G蛋白由α、β和γ3个亚基组成，能将膜受体与细胞内信号级联相联系。小GTP酶如Ras和Rho家族蛋白是具有内在GTP酶活性的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白、Rho家族Cdc42、Rac和Rho可调节肌动蛋白的细胞骨架。研究[5]证实Cdc42调节由缓激肽诱导的微端丝的形成;Rac调节生长因子诱导的膜边缘波动;Rho增加细胞的收缩能力和调节局部黏附分子及肌动蛋白张力纤维的形成，响应生长因子和溶血磷脂酸酸化作用;并证实Cdc42和Ras可调节JNK通路，Ras是细胞增殖和细胞响应外界刺激的一个重要调节子。

　　Gudi等[7]运用反义Gαq寡核苷酸处理内皮细胞可抑制剪切应力诱导的RasGTP酶活化，而乱序的寡核苷酸处理则无此作用。内皮细胞与G蛋白的抑制剂百日咳毒素作用后可阻止剪切应力介导的ERK1/2活化，也表明G蛋白的活化可响应剪切应力的作用[7]。

　　3.1.3 VEGFR2和黏附连接 VEGFR2属酪氨酸激酶受体，目前的研究证实内皮细胞在剪切应力作用数分钟后，黏附接头分子血管内皮钙黏蛋白(VEcadherin)和β连环蛋白(catenin)迁移至细胞与细胞的连接处，快速地形成VEcadherinβcatenin和VEGFR2复合物，剪切应力也可诱导VEGFR2的核转位，依赖于VEcadherin基因的表达。在内皮细胞缺乏VEcadherin基因时，Akt1和p38的活化及切应力反应元件依赖的基因转录诱导作用不会出现。因此，VEcadherinβcatenin和VEGFR2复合物在剪切应力传感与其它结构黏附接合中起重要的作用[8]。

　　3.2 内皮细胞膜结构

　　3.2.1 离子通道 血管内皮细胞有数个剪切应力敏感的K+和Ca2+通道，阻断这些敏感的离子通道很大程度上减少了内皮对流体的反应，包括内皮细胞NO释放及一氧化氮合酶(eNOS)的表达，转化生长因子b1 mRNA水平的上调和内皮素1基因表达的下调[9]。最近发现，内皮细胞Na+通道可介导剪切应力诱导的ERK1/2的活化。此外，K+和Cl-通道的药理学阻断剂可显著地减少甚至取消剪切应力诱导的Na+K+Cl-协同转运蛋白的上调，表明Na+K+Cl-协同转运蛋白响应血流的作用依赖于特异性的剪切应力敏感离子通道或更广泛的内皮细胞膜电位[10]。

　　3.2.2 Caveolae 细胞膜特异性区域Caveolae是剪切应力信号转导的另一感受器，其富含胆固醇。内皮细胞有丰富的Caveolae，在离子穿过细胞膜与信号转导中起了重要作用，主要由相对分子质量为21000～24000膜内在蛋白Caveolin组成。Caveolin作为信号分子募集和分离的脚手架区，是Caveolae进行力传导与信号转导分子相互作用的一个有效部位。已知与Caveolae相关的信号转导分子有G蛋白，cSrc家族酪

　　氨酸激酶Ras、PKC、ecNOS、shc、Grb2、mSos、Raf1和ERK1/2。目前研究发现Caveolae的抗体可抑制剪切应力诱导的ERK活化，其在剪切应力信号转导中的重要作用和能使其数量和特性改变的因素将成为未来研究的热门领域[5，11]。

　　4 动脉粥样硬化的剪切应力转导机制

　　剪切应力信号转导涉及细胞膜表面和胞浆内信号转导途径的活化。剪切应力调节内皮细胞中许多信号转导分子，包括膜K+通道、G蛋白、细胞内Ca2+、cAMP、cGMP、蛋白激酶C、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)如ERKs和JNKs、小GTP酶如Ras、PTKs如FAK的活化，这些信号转导分子的调节与许多响应剪切应力变化的基因在内皮细胞的表达有关(图1)[6]。

　　图1 血管内皮剪切应力的信号转导

　　4.1 MAPKs通路

　　MAPKs是一种普遍存在的丝氨酸/苏氨酸激酶，已知有ERK、JNK和p383种主要的亚家族。MAPKs在心血管系统能被低密度脂蛋白(LDL)、急性高血压、血管成形术、机械应激和体内外的缺血/再灌注等高度活化，在保守的苏氨酸和酪氨酸残基处发生双重磷酸化，其在控制细胞对环境反应，传递细胞生长、分化和凋亡所需的跨膜信号中发挥关键作用[9]。

　　4.1.1 Ras/ERK和JNK MAPK途径 梯度剪切应力可诱导机械化学信号转导途径Ras/MAPKs的活化，MAPKs活化的上游有小GTP酶如Ras的参与，Ras作为ERK和JNK活化的上游调节子，在激活各途径的过程中，力量依赖和异源三聚体G蛋白亚单位选择性方面是不同的，其活化通过与Gαq或Gαi偶联的G蛋白偶联受体(GPCRs)结合而触发。剪切应力诱导ERK和JNK途径中，Ras的活化能被酪氨酸激酶抑制剂genistein和herbimycin A所抑制[7，9，12]。

　　剪切应力在内皮细胞以快速和短暂的方式活化ERK和JNK，分别导致cfos基因的表达和诱导cJun磷酸化，进一步增加AP1/TRE转录活性。内皮细胞ERK和JNK的双重活化在血管生物学中具有重要的作用，ERK参与介导细胞生长，JNK可参与程序性细胞死亡[13]。

　　4.1.2 p38 MAPK途径 Rho家族成员Rho、Rac和Cdc42作为p38的上游调节子，可与GTP结合导致MAPKs激活，通过特异地双重磷酸化MKK3介导p38MAPK的活化，在细胞形态学调节中发挥重要的作用。Chien[14]指出VEGFR的酪氨酸磷酸化响应剪切应力的作用具有时间依赖性。血流剪切应力激活p38MAPK蛋白激酶2(MAPKAP激酶2)/热休克蛋白(HSP)25/27通路被认为在肌动蛋白动力学中发挥了重要作用。此外，人主动脉内皮细胞在振流(±5 dyn·cm-2 for 48 h)状态下较静置培养其鞘氨醇激酶1(SphK1)mRNA的表达水平明显增加，而层流(±20 dyn·cm-2 for 48 h)可降低SphK1 mRNA的表达水平。进一步运用小干扰RNA(siRNA)特异性阻断SphK1后，TNFα诱导的炎症基因单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和血管细胞黏附分子1(VCAM1)的表达与p38MAPK的活化受抑制[15]。

　　4.2 NFкB途径

　　NFкB是一种重要的转录因子，体内实验证实NFкB途径的启动与动脉粥样硬化的局部易感性相关，在高胆固醇血症LDLR/小鼠的主动脉易感部位NFкB的核转位和促炎症反应基因的表达增加。血流剪切应力通过TNFα导致NFкB活化，诱导内皮细胞中Eselectin、VCAM1、细胞间黏附分子1(ICAM1)、IL8等的表达，从而调节血管炎症反应。

　　此外，层流剪切应力经酪氨酸激酶cSrc和ERK1/2活化通路增加内皮eNOS的转录，这种效应可被MEK1/2抑制剂PD98059和cSrc的抑制剂PP1所阻断，表明这些信号分子是NFкB活化的上游分子。剪切应力增加eNOS转录，是通过活化NFкB P50/P65结合至人eNOS启动子区域的一个GAGACC序列。NFкB的活化通常被认为是一个促炎症反应刺激，而另一些数据表明NFкB在剪切应力作用下暂时的活化可使eNOS的表达增加，产生NO具有抗炎症和抗动脉粥样硬化的特性[12]。

　　4.3 PI3KAkt/PKB信号转导途径

　　研究表明稳定的层流剪切应力通过内皮细胞中Src激酶和VEGFR2诱导磷脂酰肌醇激酶(PI3K)蛋白激酶B(AKT)信号途径的活化，但血流刺激VEGFR2募集是否可直接活化PI3K仍不清楚。VEGFR2有一些潜在的PI3K结合位点，参与PI3K和Akt的活化。VEGFR2活化使支架蛋白Gab1募集及酪氨酸磷酸化，再结合多种信号转导分子，包括PI3K亚单位p85，二者的相互作用是PI3K响应一些受体酪氨酸激酶如表皮生长因子受体、神经生长因子受体和成纤维细胞生长因子受体作用的关键及Akt活化所需，其可诱导内皮细胞中eNOS的活化和随后的NO产生[16]。此外，剪切应力诱导ERK1/2磷酸化依赖于整合素ECM结合，经酪氨酸激酶cSrc活化。Akt磷酸化响应剪切应力的作用也需要整合素的结合，然而，人脐静脉内皮细胞与Src抑制剂除莠霉素A共培养可有效地抑制ERK1/2的活化而不影响剪切应力刺激的Akt磷酸化。因此，Akt磷酸化与剪切应力信号转导的开始共享了一条通路，但Akt磷酸化经另一通路独立调节[16]。

　　最近的研究[17]表明，Akt可刺激促凋亡蛋白Bad的磷酸化，从而抑制它的促凋亡效应，并进一步通过P70S6激酶影响蛋白转录后的稳定性，表明其在蛋白质翻译中发挥了重要作用。因此，剪切应力不仅仅干扰基因的表达，而且可在内皮细胞中经P70S6激酶活化直接调节蛋白质翻译，证实剪切应力可刺激P70S6激酶磷酸化。然而，P70S6激酶也能被Akt单独活化，这一新的信号转导通路可证实内皮细胞受到剪切应力作用后的一些功能和形态学改变。另外，在剪切应力作用下Akt磷酸化可保持细胞的生存力和与其他细胞类型的连结。剪切应力通过改变内皮细胞的生理学特点发挥了抗动脉粥样硬化作用，其诱导内皮细胞中Akt磷酸化为抗动脉粥样硬化作用提供了重要的分子学基础[17]。

　　4.4 Ca2+信号转导通路

　　Ca2+信号转导通路是内皮细胞对外界刺激，如血流剪切应力和配体结合的主要细胞内信号转导机制之一。有研究模拟了大量的化学物质在血流中的转运和内皮中钙经肌醇三磷酸(IP3)信号转导通路的动力学转运过程，证实血流剪切应力可引起内皮细胞的反应，早期内皮细胞中Ca2+浓度的升高导致其生理和生化的改变，例如血管舒张物质NO和PGI2的释放，从而通过活化相应的信号通路在动脉粥样硬化中发挥重要作用。Ca2+作为第2信使在机械力信号转导中扮演了重要角色[18]。

　　4.5 JAK/STAT3信号转导

　　2004年首次报道血流动力学可抑制IL6诱导的内皮细胞中JAK/STAT3信号转导途径的活化，近来的研究发现，炎症期间血浆中细胞因子IL6增加，IL6结合的膜受体复合物可使STAT3的Tyr705磷酸化，导致JAK/STAT3通路的激活，STAT3的活化可诱导cyclin D1、cMyc和BclxL的表达，参与细胞周期的调节。Ni等[18]指出当内皮细胞受到剪切应力作用时，以切应力依赖性方式抑制IL6诱导的STAT3磷酸化，减少了STAT3的核转位和STAT3与DNA的结合。层流剪切应力通过抑制STAT3活化而抑制内皮细胞的增殖，因此，血流剪切应力通过诱导生长阻滞蛋白的产生和抑制内皮细胞周期，为层流和高剪切应力的抗动脉粥样硬化机制提供依据。

　　5 结语和展望

　　动脉粥样硬化的发生首先出现在血液湍流和低流体剪切应力的区域。低和振流剪切应力作用可使血管内皮细胞中某些促炎症因子及凋亡基因表达上调，从而激活相应的信号转导通路，参与诱导炎症、细胞迁移、凋亡、白细胞黏附等作用，导致血管重塑和动脉粥样硬化的形成，而高剪切应力和稳定层流可通过相应的途径起到抗动脉粥样硬化的作用[19]。复杂的血流动力学与动脉粥样硬化的发生具有时间和强度选择性，研究机械力信号转导和基因表达将使我们更好地了解血流动力学因素在调节血管生理学和病理生理学中的分子机制，促进我们对动脉粥样硬化的认识。靶向性抑制剪切应力信号转导中的许多激酶及其亚型和相应的基因表达，将成为防治动脉粥样硬化的新靶点[20]。

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