作者：刘太华，刘德芳，王骏，汪晓军，罗陈
【摘要】 目的 观察苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱对巨噬细胞RAW264.7活性及分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响。方法 6孔培养板培养巨噬细胞RAW264.7，不同浓度的苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱与巨噬细胞RAW264.7共培养1 d，采用MTT法检测不同浓度的苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱对巨噬细胞RAW264.7活性的影响；收集培养液，采用ELISA方法检测每份培养液中TNF-α的含量。结果 不同浓度的苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱对巨噬细胞RAW264.7活性有不同程度的抑制作用，不同浓度的苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱对巨噬细胞RAW264.7分泌TNF-α有抑制作用，浓度越大，抑制作用越强，苦参碱对巨噬细胞RAW264.7分泌TNF-α的抑制作用更明显。结论 苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱能抑制巨噬细胞RAW264.7的活性及TNF-α的分泌，苦参碱的抑制作用更明显。
【关键词】 苦参碱；氧化苦参碱；槐定碱；巨噬细胞；肿瘤坏死因子-α；银屑病
Abstract：Objective To observe the effects of matrine， oxymatrine and sophordine on activity and TNF-α secretion of macrophage RAW264.7. Methods Macrophage were cultivated in 6 holes board and cultivated 1 day with different concentration matrine， oxymatrine and sophordine. Macrophage activity was measured with MTT and content of TNF-α in collected culture medium was measured with ELISA. Results Macrophage activity and the function of secreting TNF-α was restrained by matrine， oxymatrine and sophordine. The higher concentration of matrine， oxymatrine and sophordine was， the more intense the inhibiting effect was. The effect of matrine was more intense to the function of secreting TNF-α of macrophage. Conclusion Matrine， oxymatrine and sophordine can restrain macrophage activity and the function of secreting TNF-α， the effect of matrine is the most intense.
Key words：matrine；oxymatrine；sophordine；macrophage；TNF-α；psoriasis
笔者用川乌、附子、苦参为主药配制的乌附酒剂/乌附油剂在临床上外用治疗银屑病取得良好的效果[1-2]。为探索其对银屑病的治疗作用，我们采用苦参提取物苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱作用于巨噬细胞RAW264.7，观察其活性和分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的变化，阐明乌附酒剂/乌附油剂治疗银屑病的机理。
1 试验材料
1.1 细胞株
巨噬细胞系RAW264.7，四川瑞生科技有限公司提供。
1.2 试剂
苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱(中国药品生物制品检定所)， MTT(Sigma公司)，RPMI1640培养基(GIBCO公司)，新生小牛血清(中美合资兰州民海生物有限工程公司)，磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司)，TNF-α ELISA试剂盒(USCN Life Science &&Technology Company)，Ⅱ型胶原酶(GIBCO公司)，EDTA(Sigma公司)。
1.3 仪器
超净工作台(苏州净化设备有限公司)，倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)，Co2孵箱(SANYO，MCO-15A型，JAPAN)，酶标定量测定仪(THERMO ELECTRON CORPORATION)。
2 实验方法
2.1 试剂配制
2.1.1 1640培养基的配制
取配1 L的粉末状1640，称取2.2 g NaHCO3，用去离子水加至1 L，调pH值到7.0～7.2之间，用磁力搅拌器搅拌1 h，用0.22 μm滤器过滤，分装，用时加10%小牛血清。
2.1.2 0.25%胰酶-0.02%EDTA消化液的配制
以50 mL为例，称取0.125 g粉末状胰酶，0.01 g EDTA溶于50 mL PBS，用磁珠搅拌使其充分溶解，过滤，放4 ℃冰箱即可。
2.1.3 MTT的配制
以配制10 mL为例，称取0.05 g粉末状MTT，溶于10 mL PBS里，在电磁力搅拌机上搅拌30 min，充分溶解后，用0.22 μm的微孔膜过滤除菌，避光保存，注意在配制过程中尽量避免日光照射。
2.1.4 含苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱不同浓度培养基的配制
以苦参碱为例，取20 mg苦参碱，用微量HCl溶解，加NaOH调pH值，加入含10%小牛血清的100 mL 1640培养液中，使其充分混匀，即为20 mg/100 mL的含药培养基，然后用含10%小牛血清的1640培养基，按倍比稀释的原则，分别稀释为10、5、2.5、1.25 mg/100 mL等浓度。
2.2 ELISA法测定巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α的含量
用1640培养基培养RAW264.7细胞，细胞长满瓶底80%时，弃去培养基，加PBS液漂洗2次；加入含胰酶和EDTA的消化液1～2 mL，37 ℃消化约2 min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化，弃消化液加PBS液漂洗2次；加入新培养液10 mL，反复吹打混悬细胞，细胞密度调整为1×55/mL，以每孔1 mL细胞悬液的细胞接种量将细胞接种到6孔板，每孔再加1640培养基4 mL，然后将6孔板放入5%CO2孵箱，37 ℃培养2 d后，细胞长满瓶底80%时，弃去上清液，分别加入终浓度为20、10、5、2.5、1.25、0 mg/100 mL的含药培养基，继续培养1 d。收集每孔培养基2 mL， 1 000 r/min离心20 min，取上清液，-20 ℃保存，留作检测TNF-α。检测TNF-α按ELISA试剂盒说明书进行操作。ELISA设计见表1。表1 TNF-αELISA检测设计（）略
2.3 MTT法测定巨噬细胞活性
①接种细胞：培养的第3代RAW264.7细胞用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化液将RAW264.6细胞消化，再用含10%小牛血清培养基配成单个细胞悬液，以每孔10 000个细胞接种到48孔板，每孔体积200 μL。②48孔板分组设计。空白组：培养基＋MTT＋DMSO；对照组：细胞＋培养基＋MTT＋DMSO。③培养细胞：将培养板放入CO2孵箱，在37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养2 d后，分别给与终浓度为20、10、5、2.5、1.25 mg/100 mL的含苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱细胞培养基，继续培养1 d。④呈色：培养1 d后，每孔加MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。⑤比色：选择490 nm波长，在酶标定量测定仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
3 结果
3.1 苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱对巨噬细胞活性的影响
采用MTT方法检测苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱对培养的巨噬细胞RAW264.7活性的影响。酶标仪测定结果显示，不同浓度(20、10、5、2.5、1.25、0 mg/100 mL，下同)的苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱对巨噬细胞的活性有抑制作用，但抑制程度不与药物浓度呈线性关系，苦参碱浓度为5 mg/100 mL对巨噬细胞活性抑制作用最强，氧化苦参碱浓度为5 mg/100 mL时对巨噬细胞活性抑制作用最强，槐定碱浓度为20 mg/100 mL时对巨噬细胞活性抑制作用最强，槐定碱对巨噬细胞活性抑制程度最大(见表2)。表2 不同浓度苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱对巨噬细胞活性的影响（略）
3.2 苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱对巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α的影响
苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱作用于培养的巨噬细胞RAW264.7，对巨噬细胞分泌TNF-α有明显的抑制作用，苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱对巨噬细胞分泌TNF-α随药物浓度增加抑制作用增强，但其最佳抑制浓度与苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱抑制巨噬细胞活性的浓度不一致，提示苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱对巨噬细胞分泌TNF-α的抑制可能不是通过抑制巨噬细胞活性，而是通过抑制巨噬细胞某些生物学活性位点来实现的(见表3)。表3 TNF-αELISA检测结果(略)
4 讨论
银屑病是一种复发性慢性皮肤炎症性疾病，病因至今不明，发病机理仍不清楚。20世纪70年代认为银屑病是角质形成细胞增殖导致银屑病皮损的形成。20世纪80年代认为银屑病为T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病，T淋巴细胞异常激活，Th1/Th3平衡失调，分泌大量细胞因子，如白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α等导致角质形成细胞(KC)大量增殖和表皮的炎症，并可刺激表皮KC释放细胞因子，反过来增加T细胞的活化状态，形成一个恶性循环，最终形成银屑病皮损。T细胞分泌的干扰素-γ、TNF-β、IL-2、IL-3及IL-5等和局部微环境，其他活性细胞(KC、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等)来源的细胞因子转化生因子-α/β、TNF-α、IL-1、IL-6/IL-8和粒细胞-巨噬细胞刺激因子等形成Th1型细胞因子网络，直接影响表皮增生活性[3-4]，其中T淋巴细胞异常激活为银屑病发病的中心环节。
总结关于巨噬细胞、树突细胞以及抗TNF-α药物对银屑病的成功治疗等方面的新的研究数据，使研究者们得出一个假设：抗原提呈细胞在诱导银屑病形成以及银屑病病情的维持等方面均发挥着重要的作用[5]。银屑病皮损组织中TNF-α明显表达，广泛表达于表皮全层和真皮浅层[6]。近年来研究发现，皮肤组织中巨噬细胞在淋巴细胞激活和角质细胞异常从而导致银屑病发病的过程中发挥着重要的作用[7-8]，巨噬细胞是银屑病皮损组织中TNF-α的主要来源之一。TNF阻断剂(如依那西普、英利昔单抗、阿达木单抗)在银屑病的治疗中取得令人鼓舞的疗效，提示阻断TNF的分泌对银屑病皮损有良好的治疗作用，但生物制剂价格非常昂贵。现代药理研究发现，苦参具有很好的抗炎作用，其发挥生物学功能的有效成分为苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱等生物碱。笔者采用苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱分别作用于培养的巨噬细胞RAW264.7，结果显示，苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱对巨噬细胞的活性有抑制作用，对巨噬细胞分泌TNF-α有明显的抑制作用，且抑制作用随药物浓度增加而增强，苦参碱对巨噬细胞分泌TNF-α的抑制作用强于氧化苦参碱和槐定碱。提示苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱可能通过抑制巨噬细胞活性及抑制其分泌TNF-α的作用，从而达到抗炎的目的，对包括银屑病在内的炎症性疾病有治疗作用。
参考文献
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