作者：赵青春，董菊，杨柳，王明艳，杜逸芳
【摘要】 目的 研究山茱萸生、制品二氯甲烷萃取部位对D-半乳糖致衰小鼠骨髓细胞的影响。方法 单细胞电泳观察D-半乳糖致衰小鼠骨髓细胞DNA损伤情况，RT-PCR法检测小鼠骨髓细胞p53基因的表达情况。结果 D-半乳糖致衰模型组小鼠骨髓细胞DNA拖尾率高于正常对照组(P＜0.05)，且Ⅲ、Ⅳ级(中重度)损伤细胞数较多；山茱萸生品及制品二氯甲烷萃取部位组小鼠骨髓细胞DNA的拖尾率均低于D-半乳糖致衰模型组(P＜0.05)。D-半乳糖致衰模型组小鼠骨髓细胞p53基因的表达高于正常对照组、阳性药组及制品组。结论 D-半乳糖致衰小鼠骨髓细胞DNA有损伤，山茱萸生、制品二氯甲烷萃取部位对D-半乳糖致衰小鼠骨髓细胞有保护作用；D-半乳糖致衰小鼠骨髓p53基因表达上调，山茱萸制品二氯甲烷萃取部位能显著下调D-半乳糖致衰小鼠骨髓p53基因的表达。
【关键词】 山茱萸；二氯甲烷萃取部位；D-半乳糖；骨髓细胞；小鼠
Abstract：Objective To study the influences of dichloromethane extraction from crude and processed Cornus Officinalis on bone marrow cells of aging mice induced by D-galactose. Methods DNA damage of bone marrow cells of aging mice induced by D-galactose was detected by the comet assay， the expression of p53 mRNA was detected by RT-PCR. Results The tail formation rate of model group was significantly higher than the rate of control group (P＜0.05) with a large number of Ⅲ and Ⅳ DNA damage cells. The tail formation rate of dichloromethane extraction groups were both significantly lower than the rate of model group (P＜0.05). p53 mRNA expression of model group was higher than the rest except the crude Cornus Officinalis group. Conclusion There is DNA damage of bone marrow cells of aging mice induced by D-galactose. Both dichloromethane extraction from crude and processed Cornus Officinalis are protective. p53 mRNA expression up-regulates in model group， while its significantly down-regulation is detected in the processed Cornus Officinalis group.
Key words：Cornus Officinalis；dichloromethane extraction；D-galactose；bone marrow cells；mice
山茱萸为山茱萸科落叶小乔木植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)的干燥成熟果肉，又名枣皮、山芋、药枣、肉枣(《本草纲目》)、实枣儿(《救荒本草》)等[1-2]，其味酸、涩，微温，归肝、肾经，功能补益肝肾、涩精固脱。临床用于内热消渴、眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、尿遗尿频、崩漏带下、大汗虚脱等。近年研究表明，山茱萸具有调节免疫、降血糖、抗休克、抑制血小板聚集、抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、保肝、治疗不育症等多种药理作用[3]。本实验在以往课题研究的基础上，选取山茱萸生、制品二氯甲烷萃取部位，研究其对D-半乳糖致衰小鼠骨髓细胞的影响。
1 实验材料
1.1 药物与试剂
吐温-80、D-半乳糖，国药集团化学试剂有限公司，批号F20080324；生理盐水，上海百特医疗用品有限公司；维生素E胶丸，浙江医药股份有限公司新昌制药厂；TRIZOL，invitrogen；RT-PCR试剂盒，Promega；琼脂糖，中国医药上海化学试剂公司；TBE，生工·生物工程(上海)有限公司；正常熔点琼脂糖(NMPA)，华美生物工程公司产品；低熔点琼脂糖(LMPA)，Sigma公司产品，进口分装；TritonX-100，Amresco公司产品，进口分装；溴化乙锭(EB)，Sigma公司产品，进口分装。
1.2 动物
ICR级小鼠，(20±2)g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证：SCXK(沪)2007-0005。
2 实验方法
2.1 供试药的制备
山茱萸生品购自河南省西峡县，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为山茱萸Cornus officinalis Sied.et Zucc.的干燥成熟果肉，其炮制品由南京中药饮片厂依据《中华人民共和国药典》(一部)2005年版方法炮制，即取净山茱萸肉，加酒拌匀，置容器内加热蒸至酒吸尽，取出，干燥。山茱萸总提二氯甲烷部位的制备：取山茱萸生品、制品各500 g，用10倍量95%乙醇回流提取1.5 h，抽滤，药渣加10倍量50%乙醇回流提取1.5 h，抽滤，药渣加10倍量蒸馏水回流提取1.5 h，抽滤，合并滤液，60 ℃旋转蒸发浓缩至1 000 mL。用二氯甲烷(1∶1)萃取，直至下层近无色(5次)，合并二氯甲烷萃取液，浓缩至干，得到总提二氯甲烷生制品部位。用植物油、吐温-80、蒸馏水按1∶1∶8比例配成200 mL的乳剂(0.5 g/mL)[4]。本实验选用剂量根据前期实验摸索，选用临床等效量的高剂量[4]。
2.2 D-半乳糖溶液的制备
取D-半乳糖5 g溶于100 mL生理盐水中，制成5%D-半乳糖溶液。
2.3 阳性药的制备
阳性药选取维生素E，用植物油、吐温-80、蒸馏水按1∶1∶8比例配成200 mL的乳剂(400 mg/100 mL)。
2.4 分组与给药
取ICR级小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。分为模型组(生理盐水)、生品组(生品二氯甲烷萃取部位)、制品组(制品二氯甲烷萃取部位)、阳性药组(维生素E)、正常组(生理盐水)。各组每日按0.2 mL/10 g剂量灌胃给药1次，模型组和给药组皮下注射5%D-半乳糖溶液1次，连续30 d[5]。
2.5 动物取材
给药结束后取血，并从取血后的小鼠股骨处取出骨髓，备用。
2.6 单细胞电泳
NMPA 50 μL铺第1层胶，压片；制备好的细胞混悬液5 μL与45 μL LMPA铺作第2层胶，压片；50 μL LMPA铺第3层胶，压片；揭去盖玻片，倒入新鲜配制预冷的细胞裂解液，置4 ℃冰箱，避光裂解1 h。把预冷的DNA解旋液倾入电泳槽中，避光解旋20 min。调节电压为25 V(定压)，电流160 mA，电泳20 min。凝胶片用中和液中和漂洗3次，每次1 min。EB染色。24 h内在荧光显微镜下用515～560 nm的激发光观察并测量彗星尾长。把细胞损伤分为不同的等级，正常：＜20 μm；Ⅰ级损伤：20～40 μm；Ⅱ级损伤：40～60 μm；Ⅲ级损伤：60～80 μm；Ⅳ级损伤：≥80 μm。结果采用SPSS15.0统计软件进行数据分析。
2.7 骨髓总RNA的提取
收获骨髓细胞，生理盐水冲3次， 1 000 r/min离心10 min，取沉淀，移入1.5 mL Eppendorf管中，加入1 mL TRIZOL试剂，用加样器吹至液体澄清且无组织团块，加入0.2 mL氯仿，颠倒混匀15 s，置室温2～5 min。4 ℃、12 000 r/min离心15 min，转上层水相于另一1.5 mL EP管中。加入等体积异丙醇，混匀，置室温10 min。4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清，加入冰预冷的75%乙醇1 mL，4 ℃、7 500 r/min离心5 min，弃上清，空气干燥5～10 min。将沉淀重悬于无RNase水中，-70 ℃保存备用。
2.8 两步法RT-PCR试剂盒扩增特异性片段
依据小鼠p53基因全序列设计上下游引物，扩增引物长度250 bp的一个长片段，上游引物ACACCTGATCGTTACTCGGC，下游引物GAGGGCTTACCATCACCATC。每组各取1 g RNA进行反转录，具体操作参照试剂盒。反应条件为：RT-42 ℃ 30 min→95 ℃ 5 min→0 ℃ 5 min， PCR-94 ℃ 5 min→94 ℃ 35 s，57 ℃ 40 s， 72 ℃ 50 s，30循环→72 ℃ 10 min，end。产物在1.5%琼脂糖凝胶上调节电压为80 V(定压)电泳1 h 20 min，EB染色，用凝胶成像系统进行光密度扫描分析。
3 结果
3.1 山茱萸生、制品二氯甲烷萃取部位对D-半乳糖致DNA损伤的影响(见表1) 表1 各组DNA不同损伤等级比较（略）
3.2 RT-PCR电泳结果(见图1)
由图1可见，模型组p53基因的表达高于正常组、阳性药组及制品组，阳性药组及制品组p53基因的表达均显著低于模型组，显示出一定的保护作用，制品二氯甲烷萃取部位保护作用更显著，生品二氯甲烷萃取部位无明显保护作用。
4 讨论
D-半乳糖衰老模型是由龚氏等[6]根据衰老的代谢紊乱学说而设计的代谢紊乱衰老模型，各组织器官均出现不同程度衰老。该模型系在一定的时间内给动物连续注射D-半乳糖，使其细胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶作用下，生成半乳糖醇，后者不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀，造成细胞功能障碍，代谢紊乱，破坏并消耗机体抗氧化防御系统，使自由基积聚。同时，在半乳糖还原成半乳糖醇的过程中又产生超氧阴离子自由基使细胞膜受损，过氧化脂质、脂褐质等增高，导致拟衰老变化[7]。Cui X等[8]验证了D-半乳糖拟衰老模型的过氧化机理与氧自由基的作用结果相似，氧自由基损伤使机体加速发生拟衰老的恶性循环，造成神经元丢失，使动物出现退行性变化并伴有明显的智力低下和行为学异常。自由基学说认为，D-半乳糖进入体内引起的氧自由基代谢失衡是诱发衰老的主要原因[9]。过量的自由基可攻击包括DNA在内的几乎所有的生物分子，引起生物膜和生物大分子的脂质过氧化损伤，产生多种不同的后果(如免疫功能受损、肿瘤、畸形、衰老等)[10]。这些自由基若穿透、扩散、进入细胞核，可直接攻击DNA分子，使DNA链断裂受损，干扰DNA的复制，导致DNA损伤[11]。
DNA损伤有多种检测方法，本实验选择了单细胞凝胶电泳(Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE)，又称彗星电泳(Comet assay)。此法是利用断裂的DNA碎片在裂解液的作用下，从DNA的超螺旋结构中释放出来，在电泳时移向阳极，通过分析产生的彗星样影像对DNA进行检测的一种方法，是检验各种哺乳动物细胞DNA断裂的新技术[12]。本实验中，D-半乳糖致衰小鼠骨髓细胞DNA有损伤，与对照组比较差异显著，说明模型复制成功，其机制可能因D-半乳糖引起氧自由基代谢失衡产生的过量自由基攻击DNA分子，导致DNA损伤。山茱萸生品及制品二氯甲烷萃取部位小鼠骨髓细胞DNA的拖尾率降低，表现出一定的保护作用，山茱萸制品二氯甲烷萃取部位保护作用更明显。自由基学说认为，D-半乳糖进入体内引起的氧自由基代谢失衡是诱发衰老的主要原因[9]。过量的自由基若穿透、扩散、进入细胞核，可直接攻击DNA分子，使DNA链断裂受损，干扰DNA的复制，导致DNA损伤[11]。因此，推测山茱萸生品及制品二氯甲烷萃取部位有可能通过作用于D-半乳糖引起的氧化应激或影响自由基进入细胞核、线粒体等多种途径保护小鼠骨髓细胞DNA免受损伤。其具体作用途径有待进一步研究。
p53基因是位于17q13的抑癌基因，编码相对分量53 000 (53 kDa)的核蛋白，正常存在于细胞内的p53基因为野生型，在细胞生长过程中，以“分子警察”的身份监控细胞内DNA状态。如果DNA受损，p53基因表达增加，p53蛋白水平就增高以终止增殖，使受损细胞获得修复DNA的时间；若细胞DNA受损无法修复，则p53蛋白水平就持续增高，引起细胞凋亡。本实验中，D-半乳糖致衰模型组小鼠骨髓细胞p53基因的表达与正常对照组相比显著增高，说明模型复制成功，其机制可能为D-半乳糖引起氧自由基代谢失衡产生的过量自由基导致DNA损伤，通过一系列信号转导引起胞内p53蛋白水平急剧增高，调控细胞周期的进程，介导G1/S期和G2/M期阻滞，阻止损伤的DNA进行恶性复制，从而为DNA修复争取时间。维生素E及制品组p53基因的表达均显著低于模型组，接近正常组，说明山茱萸制品二氯甲烷萃取部位保护作用更明显。正常细胞中，由于半衰期很短(大约20 min)，p53蛋白保持在一较低浓度，p53蛋白的下游靶基因MDM2产物Mdm2具有E3泛素连接酶活性，可以通过负反馈效应介导p53的降解。而维生素E作为一种天然的抗氧化剂可明显提高D-半乳糖诱发衰老动物脑组织抗氧化能力，增强对氧自由基的清除作用，减少一氧化氮等氧化性物质的生成，改善D-半乳糖引起的氧化应激损伤，并减低脑神经细胞内Ca2+含量，阻止D-半乳糖引起氧化应激→Ca2+超载→氧化应激的恶性循环，减少对线粒体DNA的损伤作用，从而保护脑神经细胞结构和功能的完整性[13]。故推测维生素E有可能通过阻止D-半乳糖引起氧化应激→Ca2+超载→氧化应激的恶性循环而引起的DNA损伤从而保护小鼠骨髓细胞，反馈性地影响p53基因的表达。而山茱萸制品二氯甲烷萃取部位则有可能通过作用于D-半乳糖引起的氧化应激或影响自由基进入细胞核、线粒体等多种途径保护小鼠骨髓细胞DNA免受损伤，或加强骨髓细胞自身防御机制等途径直接或间接的影响p53基因的表达。其具体机制以及山茱萸生品二氯甲烷萃取部位为何反而上调p53基因的表达尚有待进一步研究。
参考文献
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