作者：唐晓琴，闫明，高莉，彭晓明，胡佳惠
【摘要】 目的 探讨含补骨脂大鼠血清对A375细胞增殖及合成黑素功能的影响。方法 体外培养A375人黑素瘤细胞，于对数生长期添加不同浓度含补骨脂大鼠血清，分别采用MTT法和NaOH法检测细胞增殖及合成黑素的情况。 结果 补骨脂高、中、低剂量含药血清组较空白血清组有明显促增殖作用，在20%的添加浓度时，高、中、低3个剂量含药血清组随着剂量的增加，黑素含量也明显升高(P＜0.01)。结论 补骨脂含药血清有促进A375黑素瘤细胞增殖作用，并使A375人黑素瘤细胞合成黑素增加。
【关键词】 补骨脂；含药血清；黑素合成；细胞增殖
Abstract：Objective To study the effects of serum containing Psoralea on proliferation and melanogenesis in A375 human melanoma cells by serum pharmacological method. Method A375 human melanoma cells were cultured in vitro. Different concentrations of drug-contained serum were added to the culture medium during logarithmic growth phase. Melanocyte culture was determined by MTT and NaOH method. Results There was a significant difference between the control and the drug-contained serum test group on proliferation， and there was significant increase in 20% serum drug-contained serum on melanogenesis (P＜0.01). Conclusion Serum containing Psoralea has strong effect of promoting A375 human melanoma cells proliferation and melanogenesis in vitro.
Key words：Psoralea；drug contained serum；melanogenesis；cell proliferation
补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的果实，性味辛、苦、温，归肾、脾经[1]，具有温肾助阳、纳气、止泻功效。历代中医常用于治疗肾虚、遗尿、泄泻、白癜风、秃发。研究发现，补骨脂95%乙醇提取物对酪氨酸酶有明显的激活作用[2]，对黑素细胞的迁移和粘附也有明显的促进作用[3]。本实验采用体外培养的A375人黑素瘤细胞作为模型，研究补骨脂含药血清对A375人黑素瘤细胞增殖及黑素含量的影响，进一步探讨其药用机制。
1 实验材料
1.1 药物
补骨脂，新疆华康制药公司提供。
1.2 试剂与仪器
A375人黑素瘤细胞由上海中国科学院细胞库提供。DMEM (GIBCO)，MTT(Amresco)，CO2培养箱(SANYAO)，酶标仪(BIO-RAD)等。
1.3 动物
SD大鼠24只，雄性，体重(200±20)g，新疆自治区疾病控制中心实验动物中心提供，许可证号：SYXK(新)2003- 0003。
2 实验方法
2.1 分组、给药及含药血清制备[4-5]
按完全随机化设计方案，将24只大鼠分为4组，每组6只。药物粉末过100目筛制备为CMC-Na混悬剂。具体分组给药操作如下：正常对照组灌胃生理盐水；补骨脂低(0.038 g/d)、中(0.19 g/d)、高(0.38 g/d)剂量组每日分2次灌胃，连续给药3 d，正常饮食饮水。末次给药后2～3 h腹主动脉无菌取血，分离血清，0.22 μm微孔滤膜除菌，-20 ℃保存备用。
2.2 A375细胞的培养
含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养[6]。
2.3 细胞增殖测定
采用MTT法测定[7]。每次实验取同一传代细胞，取对数生长期A375细胞，0.25%胰酶消化3 min，0.4%台盼蓝计数。使用含10%胎牛血清的完全DMEM培养基调整细胞浓度为5×104/mL，接种于96孔板，每孔100 μL。5% CO2培养箱中37 ℃培养24 h。弃去培养基，加入3个剂量不同浓度的含药血清培养液100 μL，对照组加入100 μL的10%空白血清培养液继续培养48 h。48 h后，加5 mg/mL MTT 20 μL/孔，37 ℃、5%CO2培养4 h后弃上清，加入DMSO 150 μL，震荡10 min左右。立即于490 nm测定吸光度值。用吸光度值(OD)表示细胞增殖活性。
2.4 黑素生成测定
采用NaOH法测定[7-8]，并稍加改动。细胞培养方法和分组方法同上。放入5%CO2培养箱中37 ℃继续培养48 h后，弃去培养基，PBS液洗2遍。加入1 mol/L NaOH 100 μL/孔，37 ℃放置24 h；于490 nm测定吸光度值。用吸光度值(OD)表示黑素含量。
3 统计学方法
实验结果以—x±s表示，组间差异的显著性检验采用SPSS10.0软件进行方差分析，用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。x
【摘要】 目的 探讨含补骨脂大鼠血清对A375细胞增殖及合成黑素功能的影响。方法 体外培养A375人黑素瘤细胞，于对数生长期添加不同浓度含补骨脂大鼠血清，分别采用MTT法和NaOH法检测细胞增殖及合成黑素的情况。 结果 补骨脂高、中、低剂量含药血清组较空白血清组有明显促增殖作用，在20%的添加浓度时，高、中、低3个剂量含药血清组随着剂量的增加，黑素含量也明显升高(P＜0.01)。结论 补骨脂含药血清有促进A375黑素瘤细胞增殖作用，并使A375人黑素瘤细胞合成黑素增加。
【关键词】 补骨脂；含药血清；黑素合成；细胞增殖
Effect of Psoralea on Proliferation and Melanogenesis in A375 Human Melanoma Cell
TANG Xiao-qin1， YAN Ming2， GAO Li2， et al
(Pharmacy College of Shihezi University， Shihezi 832000， China；Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine， Urumqi 830049， China)
Abstract：Objective To study the effects of serum containing Psoralea on proliferation and melanogenesis in A375 human melanoma cells by serum pharmacological method. Method A375 human melanoma cells were cultured in vitro. Different concentrations of drug-contained serum were added to the culture medium during logarithmic growth phase. Melanocyte culture was determined by MTT and NaOH method. Results There was a significant difference between the control and the drug-contained serum test group on proliferation， and there was significant increase in 20% serum drug-contained serum on melanogenesis (P＜0.01). Conclusion Serum containing Psoralea has strong effect of promoting A375 human melanoma cells proliferation and melanogenesis in vitro.
Key words：Psoralea；drug contained serum；melanogenesis；cell proliferation
补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的果实，性味辛、苦、温，归肾、脾经[1]，具有温肾助阳、纳气、止泻功效。历代中医常用于治疗肾虚、遗尿、泄泻、白癜风、秃发。研究发现，补骨脂95%乙醇提取物对酪氨酸酶有明显的激活作用[2]，对黑素细胞的迁移和粘附也有明显的促进作用[3]。本实验采用体外培养的A375人黑素瘤细胞作为模型，研究补骨脂含药血清对A375人黑素瘤细胞增殖及黑素含量的影响，进一步探讨其药用机制。
1 实验材料
1.1 药物
补骨脂，新疆华康制药公司提供。
1.2 试剂与仪器
A375人黑素瘤细胞由上海中国科学院细胞库提供。DMEM (GIBCO)，MTT(Amresco)，CO2培养箱(SANYAO)，酶标仪(BIO-RAD)等。
1.3 动物
SD大鼠24只，雄性，体重(200±20)g，新疆自治区疾病控制中心实验动物中心提供，许可证号：SYXK(新)2003- 0003。
2 实验方法
2.1 分组、给药及含药血清制备[4-5]
按完全随机化设计方案，将24只大鼠分为4组，每组6只。药物粉末过100目筛制备为CMC-Na混悬剂。具体分组给药操作如下：正常对照组灌胃生理盐水；补骨脂低(0.038 g/d)、中(0.19 g/d)、高(0.38 g/d)剂量组每日分2次灌胃，连续给药3 d，正常饮食饮水。末次给药后2～3 h腹主动脉无菌取血，分离血清，0.22 μm微孔滤膜除菌，-20 ℃保存备用。
2.2 A375细胞的培养
含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养[6]。
2.3 细胞增殖测定
采用MTT法测定[7]。每次实验取同一传代细胞，取对数生长期A375细胞，0.25%胰酶消化3 min，0.4%台盼蓝计数。使用含10%胎牛血清的完全DMEM培养基调整细胞浓度为5×104/mL，接种于96孔板，每孔100 μL。5% CO2培养箱中37 ℃培养24 h。弃去培养基，加入3个剂量不同浓度的含药血清培养液100 μL，对照组加入100 μL的10%空白血清培养液继续培养48 h。48 h后，加5 mg/mL MTT 20 μL/孔，37 ℃、5%CO2培养4 h后弃上清，加入DMSO 150 μL，震荡10 min左右。立即于490 nm测定吸光度值。用吸光度值(OD)表示细胞增殖活性。
2.4 黑素生成测定
采用NaOH法测定[7-8]，并稍加改动。细胞培养方法和分组方法同上。放入5%CO2培养箱中37 ℃继续培养48 h后，弃去培养基，PBS液洗2遍。加入1 mol/L NaOH 100 μL/孔，37 ℃放置24 h；于490 nm测定吸光度值。用吸光度值(OD)表示黑素含量。
3 统计学方法
实验结果以—x±s表示，组间差异的显著性检验采用SPSS10.0软件进行方差分析，用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 补骨脂含药血清对A375黑素瘤细胞增殖的影响
结果显示，随着添加浓度的增加，含药血清组和空白血清组对细胞增殖的促进作用也逐渐增加，含药血清浓度为5%时，高、中、低各剂量组均未呈现出增殖作用。在10%的血清添加浓度时，低、中剂量含药血清对A375细胞有明显的促增殖作用；在20%的血清添加浓度时，中、高剂量含药血清对A375细胞均有明显的增殖作用；在30%的血清添加浓度时，低、中剂量含药血清明显促进A375细胞的增殖。结果见表1。表1 补骨脂含药血清对A375人黑素瘤细胞增殖的影响(略)
4.2 补骨脂含药血清对A375人黑素瘤细胞黑素含量的影响
与正常对照组比较，在20%的添加浓度时，高、中、低3个剂量组含药血清随着剂量的增加，黑素含量也明显升高(P＜0.01)，呈剂量依赖性；在30%的添加浓度时，仅高剂量组的黑素生成量与空白血清组比较差异有统计学意义。结果见表2。表2 补骨脂含药血清对A375人黑素瘤细胞黑素含量的影响(略)
5 讨论
血清药理学是近年来建立和发展起来的一种适合于体外研究中药药理的新方法，主要是通过研究给药动物血清的生物学活性来揭示药物作用机理。鉴于药物在动物体内代谢是一个复杂的过程，本实验设置了多个采血时间点，发现给药2～3 h后药物血清表现出更强的促细胞增殖作用，而6 h后药物活性显著降低，促细胞增殖作用减弱。大量实验表明，血清灭活与否要依据不同的药物而定，韩氏[9]认为，最好选用未灭活的血清，这样既可全面反映中药的作用机理，又与体内实验和临床用药情况相符。本实验还比较了灭活血清和未经灭活的血清对A375人黑素瘤细胞增殖的影响，发现未经灭活的含药血清药效更明显，故选用未经灭活的血清用于实验。
本实验应用MTT比色分析和NaOH法检测补骨脂含药血清对A375人黑素瘤细胞增殖和黑素合成的影响，结果显示，补骨脂不仅能显著促进A375人黑素瘤细胞增殖，还能显著促进黑素的合成。黑素合成是个复杂的过程，有研究发现，补骨脂对豚鼠皮肤酪氨酸酶mRNA表达有显著的促进作用[10]，而李氏等[11]的研究表明，补骨脂对体外培养的黑素细胞酪氨酸酶基因蛋白的表达有抑制作用，故补骨脂促进黑素合成的途径是促进酪氨酸酶蛋白表达还是提高其活性有待进一步研究。促进黑素合成的还有多种信号途径，目前研究的较为清楚的有二脂酰甘油/蛋白激酶C途径、一氧化氮/环磷酸鸟苷/蛋白激酶G途径、环磷酸腺苷/蛋白激酶A途径和丝裂原激活的蛋白激酶级联途径[12]。补骨脂对黑素生成的促进作用究竟是通过哪个环节和途径需要继续深入研究。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社，2005.129.
[2] 徐建国，尚 婧.补骨脂对酪氨酸酶的激活作用[J].中草药，1991，22(4)：168.
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[4] 崔 玲，高天文，党育平，等.含中药血清对体外黑素细胞增殖及黑素合成量的影响[J].中国皮肤性病学杂志，2005，19(1)：19－21.
[5] 杨彦芳，王玉芹.中药复方血清药理学方法规范化探讨[J].中国西医结合">中西医结合杂志，2000，20(5)：380.
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[7] 刘志军，刘 晶，张焕梅.消白合剂对人A375黑素瘤细胞株黑素合成的影响[J].上海中医药杂志，2009，43(1)：81－83.
[8] 邓瑞春，周 勇，章金刚，等.驱虫斑鸠菊对B-16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性及黑素生成影响[J].氨基酸和生物资源，2002，24(1)：31－32.
[9] 韩 俭.中药血清药理学方法学研究——抗菌试验含药血清处理方案的研究[J].中药药理与临床，2002，18(1)：47－48.
[10] 涂彩霞，刘亚玲，马景昕.旱莲草等中药对皮肤酪氨酸酶mRNA表达的影响[J].中华临床医药，2005，5(4)：9－11.
[11] 李永伟，许爱娥，Ruth Halaban.单味中药提取物对体外培养的黑素细胞酪氨酸酶基因和c-kit基因表达的激活作用[J].中华皮肤科杂志， 2004，37(10)：598－600.
[12] 雷铁池.与表皮黑素细胞增殖和黑素生成有关的信号转导[J].国外医学·皮肤性病学分册，1999，25(1)：32－35.