【摘要】 目的 探讨当归红芪合剂超滤膜提取物对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响。方法 以体外培养的ECV-304细胞为模型，采用四氮唑蓝比色法(MTT法)测定细胞增殖，半定量反转录-聚合酶链反应法检测ECV-304细胞VEGF mRNA表达的变化。结果 当归红芪合剂超滤膜提取物对ECV-304细胞有促增殖的作用，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；当归红芪合剂超滤膜提取物能够诱导VEGF mRNA的表达，其作用与剂量呈正相关。结论 当归红芪合剂超滤膜提取物对ECV-304细胞的促增殖作用机制是通过诱导ECV-304细胞VEGF mRNA表达实现的。
【关键词】 当归；红芪；内皮细胞；血管内皮生长因子
Abstract：Objective To study the effect of the ultra-filtration extract from Angelica sinensis and Hedysarum polybotrys’s mixture on the VEGF mRNA expression of ECV-304 cell. Method Angelica sinensis and Hedysarum polybotrys’s mixture were refined by ultra-filtration technique. ECV-304 cells were cultured as model， and its proliferation was detected by MTT colorimetry. VEGF mRNA expression was observed by semi-quantitative RT-PCR. Results The ultra-filtration extract from Angelica sinensis and Hedysarum polybotrys’s mixture could markly promote the growth of ECV-304 cells， there was significant difference between experimental and control group (P＜0.05). The ultra-filtration extract from Angelica sinensis and Hedysarum polybotrys’s mixture upregulated VEGF mRNA expression with dose-dependent relation. Conclusion The ultra-filtration extract from Angelica sinensis and Hedysarum polybotrys’s mixture can markly promote ECV-304 cell proliferation， which may be related to the expression of VEGF mRNA.
Key words：Angelica sinensis；Hedysarum polybotrys；ECV-304 cell；VEGF
当归、红芪是甘肃道地药材，当归有补血活血之功效，红芪又名“多序岩黄芪”，具有补气固表、敛疮生肌功效。当归、
黄芪按1∶5配伍所组成的当归补血汤是中医补气生血的经典方，现代药理学研究发现红芪、当归有显著的抗心肌缺血作用。益气生血、补血活血中药的药效是否与促进血管新生有关，当归红芪合剂(1∶5)的有效成分中是否具有促进血管新生的活性成分，本研究对此进行了探讨。
1 实验材料
1.1 药物与细胞系
红芪购自甘肃宕昌县，当归购自甘肃岷县。人脐静脉内皮细胞(ECV-304)，购自中国典型培养物保藏中心。
1.2 试剂
DMEM培养基，美国Sigma公司产品。胎牛血清，杭州四季青产品。四氮唑蓝(MTT)试剂、碘化丙啶(PI)，华美生物工程公司产品。其他化学试剂均为分析纯，天津化工试剂厂提供。
1.3 仪器
5万分子量超滤膜，甘肃省膜科学技术研究所提供。超滤设备，主要组件为海德能公司产品，甘肃省膜科学技术研究所研制。细胞CO2培养箱：SCP-2000型，美国Shill公司产品。流式细胞仪：XL型，美国Coulter公司产品。酶联免疫检测仪：DG-5031型，国营华东电子管厂产品。
2 实验方法
2.1 药物制备
称取当归饮片500 g、红芪饮片2 500 g，混合，加水浸泡，煎煮后倾出药液，趁热棉花过滤，冷却后上超滤设备。首先陶瓷膜微滤当归浓缩液[技术参数为压力0.5 kPa/m3、温度25 ℃、流量100 L/(h·m2)]；其次PNA中空纤维超滤膜(截留分子量5万)超滤经微滤处理的红芪、当归配伍的水煎液[压力5～6 kg/m3、温度25 ℃、流量100 L/(h·m2)]。将5万分子量以下超滤液浓缩至相当于每毫升药液含原药材量为1 g，高压灭菌，冷却后置冰箱(4 ℃)贮藏备用。
2.2 细胞培养
采用常规培养ECV-304细胞，培养液为含5%的胎牛血清，青、链霉素各100 U/mL的DMEM，在37 ℃、饱和湿度、5% CO2孵箱中培养，每2～3 d用0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化传代。
2.3 分组
实验分为用药组和对照组：用药组细胞培养液中分别加入不同浓度当归红芪合剂超滤膜提取物，从而形成不同药物浓度培养下的ECV-304细胞；对照组为细胞培养液中加等量的PBS所培养的ECV-304细胞。
2.4 细胞增殖率测定
采用MTT法。将ECV-304细胞悬液调整为4×104/mL，接种于96孔培养板，每孔100 μL，常规培养24 h细胞贴壁后，实验组分别于细胞培养液中加入当归红芪合剂的超滤膜提取物，并配制成不同浓度；对照组于细胞培养液中加入等量的PBS，调零孔只加等量的细胞培养液无细胞，每组8个复孔，分别于加药后24、48、72、96 h在各孔加入MTT 10 μL。继续培养4 h，终止培养，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，用酶联免疫检测仪测定各孔在490 nm处的吸光度值(A490)，按下式计算细胞增殖率(PR)：PR＝(A用药/A对照－1)×100%。
2.5 反转录-聚合酶链反应法检测血管内皮生长因子mRNA表达
按试剂盒说明提取细胞内总RNA，根据文献[1]选用特异性引物。VEGF上游引物：5’-AAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATG-3，VEGF下游引物：5’-GCGAATTCCT GCCCGCGCTGAC-3’，B-actin上游引物：5’-AACACCCAGCCATGTACGTTG-3’，B-actin下游引物：5’-CGG ATGTCCACGTCACACTTCAT-3’。参照文献[1]略加改进：42 ℃ DNA合成45 min，94 ℃预变性4 min，94 ℃预变性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃ ∞，上PCR反应仪进行热循环。预计产物长度：VEGF 121为246 bp， VEGF 165为375 bp，B-actin为509 bp。各组取10 μL扩增产物溶液加入含0.5 mg/L溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶孔中，同时一孔内加入与0.25%溴酚蓝混匀的Marker作参照。在恒温、电压5 V/cm、恒流75 mA于1×TBE缓冲液中电泳1～2 h，在凝胶图像成像系统下获得图像，用凝胶图像分析系统分析所获图像上的各条带的光密度，以VEGF 165基因条带的光密度参数与B-actin条带的光密度参数的比值做为该标本mRNA的表达参数。重复上述实验4次。
3 统计学方法
用SPSS软件对实验数据进行处理，结果用—x±s表示，多组间均数比较用单因素方差分析和q检验。
4 结果
4.1 当归红芪合剂对ECV-304细胞血管内皮生长因子mRNA表达的影响(见图1、表1)
表1 ECV-304细胞在当归红芪合剂超滤膜提取物处理48 h后VEGF mRNA
4.2 当归红芪合剂超滤膜提取物对ECV-304细胞增殖的影响(见表2)
表2 当归红芪合剂超滤膜提取物作用于ECV-304细胞不同时间细胞增殖率比较(略)
从表2可以看出，在1.5～21.0 g/L浓度范围内，当归红芪合剂超滤膜提取物作用ECV-304细胞48 h，有显著的促ECV-304细胞增殖的作用。从增殖率看，在7.5～15.0 g/L浓度范围，当归红芪合剂超滤膜提取物促ECV-304细胞增殖的作用最强；比较在相同浓度下，当归红芪合剂超滤膜提取物作用ECV-304细胞24、48、72、96 h的增殖率结果，提示当归红芪合剂超滤膜提取物作用ECV-304细胞48 h促增殖效果最明显；在3.0～9.0 g/L浓度范围内，当归红芪合剂超滤膜提取物作用ECV-304细胞24、48、72 h，均有显著的促ECV-304细胞增殖的作用，并且其最佳作用时间为48 h；当归红芪合剂超滤膜提取物促ECV-304细胞增殖的最大增殖率为44.31%，当归红芪合剂超滤膜提取物的用药范围在1.5～21.0 g/L。
4.3 药物鉴定及制备结果
当归、红芪经甘肃中医学院药学院生药学教研室李成义教授鉴定，分别为伞形科当归属的根和豆科岩黄芪属植物多序黄芪的干燥根茎。实验所用当归红芪合剂5万分子量以下超滤膜提物具有稳定性强、可重复性好的特点。
5 讨论
本研究利用甘肃省膜科学技术研究所已有技术和设备优势，应用超滤技术对当归红芪合剂进行了精制。超滤技术不需要加热，不需要添加化学试剂，操作条件温和，没有相态变化，具有破坏有效成分的可能性小、能耗少、工艺流程短等优点，近年来正逐渐地被用于中药成分的分离、纯化、精制[2]。实验过程中所用当归红芪合剂5万分子量以下超滤膜提取物具有稳定性强、实验可重复性好的特点。
血管新生的许多关键步骤均需内皮细胞参与，内皮细胞在血管生成中具有非常重要的作用。利用体外培养血管内皮细胞，已广泛应用于血管新生的研究当中，ECV-304细胞具有一般内皮细胞的某些特征，而且还具有可无限传代、不依赖特殊生长因子就能存活等特点[3]。李氏等[4]利用ECV-304细胞在体外成功构建血管新生的三维模型，证明ECV-304细胞可用于血管新生的研究，所以本实验以体外培养的内皮细胞株ECV-304细胞为模型。
MTT法是检测细胞增殖的经典方法，可间接反映活细胞的数目。本实验结果显示，当归红芪合剂有明显促进ECV-304细胞增殖的作用；应用反转录聚合酶链反应技术分析了当归膜提取物作用ECV-304细胞后VEGF mRNA表达的变化。研究结果表明，当归超滤膜提取物可以诱导VEGF mRNA的表达，说明当归超滤膜提取物可能是通过诱导VEGF mRNA的表达而发挥其促内皮细胞增殖的作用。基于VEGF广泛的生物学效应及内皮细胞的增殖在血管新生中的重要性，提示当归红芪合剂超滤膜提取物中可能存在一些活性物质，具有促血管新生的作用，其作用可能发挥在血管新生的多个环节，而不是仅仅在内皮细胞增殖这一个环节上起作用，这些活性物质可能在一些缺血性疾病中有一定的应用价值。
参考文献
[1] Jian-Wei Zhu， Bao-Ming Yu， Yu-Bao Ji， et al. Upregulation of vascular endothelial growth factor by hydrogen peroxide in human colon cancer[J]. World J Gastroenterol，2002，8(1)：153－157.
[2] 彭国平，郭立玮，徐丽华，等.超滤技术应用对中药成分的影响[J].南京中医药大学学报，2002，18(6)：339－341.
[3] Suda K， Rothen-Rutishauser B， Gunthert M， et al. Phenotypic characterization of human umbilical vein endothelial(ECV304) and urinary carcinoma (T24) cells：endothelial versus epithetial features[J]. In Vitro Cell Dev Biol，2001，37(8)：505.
[4] 李明焕，田 烨，刘执玉，等.ECV304细胞用于三维血管新生的研究[J].中国现代普通外科进展，2004，7(3)：165－167.