【摘要】 目的 研究应激法诱导的肠易激综合征(IBS)模型大鼠抗氧化能力变化及宁肠汤对氧自由基的调节作用。方法 实验动物随机分为6组：正常组、模型组、阳性对照组及宁肠汤高、中、低剂量组，以慢性束缚＋夹尾刺激作为应激原诱导IBS大鼠模型。正常组、模型组给予生理盐水灌胃，中药组予不同剂量宁肠汤药液灌胃，阳性对照组予匹维溴胺水溶液灌胃，共用药4周。测定大鼠丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)活性，观察宁肠汤对IBS大鼠抗自由基氧化能力的调节作用。结果 慢性束缚＋夹尾刺激诱导的IBS大鼠抗氧化能力降低，血清MDA含量增高，SOD、T-AOC活性降低(P&<0.05～0.01)。宁肠汤能降低IBS大鼠血清MDA含量，增高血清SOD、T-AOC活性(P&<0.05～0.01)。结论 宁肠汤可以提高IBS大鼠的抗氧化能力。
【关键词】 宁肠汤；应激；肠易激综合征；自由基；大鼠
肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一组包括腹痛、腹胀、排便习惯和大便性状异常，可持续存在或间歇发作，但又缺乏明显形态学和生化学异常可以解释的证候群，其病因和发病机制目前尚不完全清楚。国内调查研究显示：IBS患者占消化科门诊量的30%～50%，北京地区符合罗马Ⅱ标准和manning标准的检出率分别是0.82%与7.01%，男女之比约为1︰1.15，多见于18～30岁的青少年[1]。本病虽呈良性经过，但由于发病率高、病情缠绵，严重影响患者的生活质量。目前，自由基的研究已广泛运用于许多疾病的发病及治疗机理研究中，它可以从分子水平反映机体的整体变化。为深入研究调肝健脾中药复方宁肠汤的作用机制，笔者采用慢性束缚＋夹尾刺激作为心理应激原诱导IBS大鼠模型，研究应激对IBS大鼠抗自由基氧化能力的影响及宁肠汤的干预作用。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物
同批清洁级雄性SD大鼠70只，体重(200±10)g，浙江中医药大学实验动物中心提供。
1.2 药物
宁肠汤组方：柴胡10 g，炒白芍15 g，钩藤15 g，陈皮10 g，茯苓15 g，白术15 g，当归10 g，灵芝30 g，将中药材用水浸泡，煎煮2次，过滤，浓缩为含有原药材1.5 g/mL的药液。阳性对照药为匹维溴胺(法国苏威制药，批号0410)，用蒸馏水配制成2 mg/mL的混悬液。
1.3 试剂与仪器
超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号0606)、丙二醛(MDA)试剂盒(批号0605)、总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒(批号0607)均购自南京建成生物工程研究所。BECKMAN型离心式全自动生化仪(美国实验仪器公司生产制造)，722分光光度仪(美国PACKARO公司生产制造)。
1.4 造模
参照文献[2-3]，以慢性束缚应激＋夹尾刺激法诱导IBS大鼠模型。大鼠每5只同笼，用裹有海绵的夹子夹大鼠尾巴近端1/3处，注意不损伤皮肤，使其激怒，寻衅与其他大鼠撕打，从而激怒全笼大鼠打斗，观察大鼠激怒应激反应(粗叫、站立对峙、扭叫撕咬等)，刺激时间持续30 min。夹尾刺激结束1 h后，大鼠予30%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，用纸带束缚前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓头面部，但不控制其活动。自大鼠清醒后开始计时，束缚时间为2 h。正常组大鼠不予任何刺激。造模时间为14 d。
1.5 分组及给药
大鼠适应性喂养1周后，按简单随机化原则，根据体重先分成正常组(20只)和实验组(50只)。造模过程中各组随机取10只大鼠检测小肠运动功能。造模成功后的实验组大鼠再按随机化原则分为模型组、匹维溴胺组和宁肠汤高、中、低剂量组，每组8只。造模结束后第2日起，各组大鼠分别灌胃给药，实验剂量按照试验动物研究“等效剂量”的计算方法[4]。宁肠汤高、中、低剂量组给药量分别为30、15、7.5 g/kg·d，匹维溴胺组给药量为15 mg/(kg·d)，正常组、模型组灌服生理盐水作为安慰对照。各组连续给药14 d。
1.6 指标测定
1.6.1 结肠转运功能
大鼠实验前24 h禁食，予30%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，取直径为3 mm的玻璃小球放入距肛门3 cm的直肠内。大鼠苏醒后迅速移至笼内喂食饮水，笼内垫清洁滤纸，观察束缚2 h内大鼠排便的粪点数和直肠内玻璃小球排出时间。实验第7、14日及给药结束后第2日分别检测，以验证模型有效性及观察宁肠汤的调节作用。
1.6.2 小肠运动功能
大鼠以50%墨汁灌胃(2 mL/只)，10 min后处死。剖取大鼠小肠，分别测量小肠墨汁推进百分率。推进率(%)＝幽门至墨汁前沿的距离/幽门至回盲部的距离×100%。实验第7、14日，正常组、实验组各随机取5只大鼠检测以验证模型有效性。给药结束后第2日观察宁肠汤的调节作用。
1.6.3 结肠黏膜病理学观察
实验第7、14日，正常组、实验组各随机取5只大鼠，检测小肠运动功能后，剖取乙状结肠0.5 cm，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，HE染色，光学显微镜下观察大鼠结肠黏膜病理组织学改变。
1.6.4 血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶、总抗氧化能力测定
给药结束后第2日，各组大鼠摘眼球取血，分离血清。SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法，MDA测定采用硫代巴比妥酸法，T-AOC测定采用比色法。
1.7 统计学方法
采用SPSS10.0版统计软件，计量数据以x±s表示，组间差异的比较采用方差分析。
2 结果
(见表1～表5)表1 宁肠汤对IBS大鼠结肠转运功能的调节作用(略)注：与正常组比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与模型组比较，△P&<0.05，△△P&<0.01(下同)表2 慢性束缚加夹尾刺激对大鼠小肠运动功能的影响(略)表3 宁肠汤对IBS大鼠小肠运动功能的调节作用(略)表4 IBS大鼠抗氧化能力变化及宁肠汤干预作用(略)表5 慢性束缚+夹尾刺激对大鼠结肠转运功能的影响(略)
3 讨论
应激是神经体液调节的一种复杂反应，在人类常常导致胃肠功能失调，表现为胃肠运动、分泌和消化转运时间的改变。不同的应激刺激引起不同程度的消化道功能紊乱。精神病学家认为IBS是一种精神因素躯体化症状的疾病。夹尾刺激是一种常用的精神刺激，动物实验表明，经常受慢性精神刺激的大鼠肠黏膜上皮细胞显著增加，同时黏膜上皮的通透性增加[5]。束缚应激是一种对肠黏膜轻微的、非溃疡形成的刺激，可诱发肠道转运加快以及内脏敏感性增加[6]。制约IBS深入研究的瓶颈是缺乏反映IBS发病特征的动物模型。结合现代应激学说，以慢性束缚＋夹尾刺激作为心理应激原，诱导IBS大鼠模型，实验结果表明，模拟情志致病，慢性束缚＋夹尾刺激后大鼠小肠运动、结肠转运明显增加(P&<0.05～0.01)，结肠黏膜病理学观察无明显病理组织学改变，可作为研究IBS发病机制及其治疗较为理想的实验动物模型。
近年来自由基在很多系统的疾病研究中得到重视，研究表明，SOD、MDA等氧自由基在疾病的发生发展中发挥了重要作用。正常情况下，机体通过酶系统和非酶系统产生一定量的氧自由基，可被机体的自由基清除系统迅速清除，不至于堆积过多而引起组织细胞损伤。病理情况下，机体自由基清除系统功能下降，自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA)，引发脂质过氧化反应，并形成脂质过氧化物，如醛基、酮基以及新的氧自由基。脂质过氧化物通过链式反应起到放大作用，形成更多的脂类分解产物。而一些分解产物是有害的，不但可通过生物膜中PUFA的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解引起细胞质膜破坏和功能障碍。在IBS患者中，由于血液中自由基清除剂的缺乏，使胃肠神经极易受到自由基的损害。自由基的过氧化作用使细胞膜、细胞内微环境、能量代谢和遗传等方面均发生破坏性的变化，导致了神经细胞的功能障碍、细胞变性、坏死。MDA的量常可反映机体内脂质过氧化的程度，反映出机体细胞受自由基攻击的严重程度。而SOD能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，对机体氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，其活力高低反映了机体清除氧自由基的能力[7]。本实验观察到，应激致IBS大鼠MDA含量升高，SOD、T-AOC活性降低(P&<0.05～0.01)，表明IBS机体抗氧化能力低下，自由基代谢产物储积。
情志失调导致肝木乘脾是IBS发病的主要病机，如叶桂所云：“肝病必犯土，克脾则腹胀，便或溏或不爽。”中医治疗往往以调肝为主，健脾为辅。从中医角度而言，任何形式的应激主要是影响机体正常的气机，而肝脏是机体调节心理应激反应的核心，肝主疏泄而气机调畅[8]。宁肠汤以调肝健脾立方，前期实验表明，宁肠汤可调整紊乱的胃肠神经递质的分泌、释放，可抑制下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴兴奋状态，调节免疫功能。本实验结果表明，宁肠汤能降低IBS大鼠MDA含量，升高SOD、T-AOC活性(P&<0.05～0.01)，推测其可能通过增强IBS大鼠机体的抗自由基氧化能力，清除蓄积自由基，从而维持细胞内环境的稳定和机体功能障碍而达到治疗作用。
【参考文献】
1] 潘国宗，鲁素彩，柯美云，等.北京地区肠易激综合征的流行病学研究：一个整群、分层、随机的调查[J].中华流行病学杂志，2000，2l(1)：26－28.
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