作者：李军昌，王 文，王宗仁，郑建勇，刘家云
【摘要】 目的 观察芪丹通脉片对缺血/再灌注大鼠心肌一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的影响。方法 将雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血/再灌注模型组、芪丹通脉片＋缺血/再灌注Ⅰ组、芪丹通脉片＋缺血/再灌注Ⅱ组。大鼠麻醉开胸，结扎冠状动脉前降支40 mim，再灌注4 h。TUNEL法测定大鼠心肌组织的细胞凋亡，化学比色法检测心肌组织中总的一氧化氮合酶(NOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性，并计算出结构型一氧化氮合酶(cNOS)的活性。结果 不同剂量的芪丹通脉片预处理抑制缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡，其凋亡指数与模型组比较均存在显著差异(P&<0.05，P&<0.01)。与假手术组比较，模型组心肌组织iNOS的活性增加(P&<0.05)，cNOS活性降低(P&<0.01)。不同剂量的芪丹通脉片能够抑制心肌缺血/再灌注大鼠iNOS的活性(P&<0.05)，增加cNOS活性(P&<0.05，P&<0.01)。结论 芪丹通脉片能够抑制缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡可能与调节心肌组织中NOS的活性有关。
【关键词】 芪丹通脉片；缺血/再灌注损伤；心肌；一氧化氮合酶；大鼠
缺血性心脏病本质的病理改变是缺血心肌细胞因缺氧而坏死或凋亡，尽早恢复血液灌流是治疗缺血性心脏病的首要措施。然而，再灌注损伤成为患者从缺血后复流获益的最大障碍。再灌注过程中，内源性一氧化氮(NO)所具有的双重性生物效应与NO的来源、释放的量以及靶组织的状态等多种调控环节相关。心肌中的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是NO的限速酶，其同功酶的活性影响着NO的生物效应。芪丹通脉片能够减少急性心肌梗死面积，促进心脏功能恢复[1]，并改变犬心肌和血清中NO的水平[2]。本观察其对急性缺血/再灌注心肌细胞凋亡和再灌注心肌NOS的影响。
1 实验材料
1.1 动物
健康成年SD雄性大鼠30只，体重250～270 g，第四军医
大学动物中心提供，合格证号：200505。
1.2 药物和主要试剂
芪丹通脉片提取浸膏干粉(黄芪30 g，丹参30 g，当归15 g，红花30 g，桂枝10 g，2.862 g原药材/g干粉)由中国人民解放军第四军医大学科研药厂提供，以生理盐水配制成混悬液324 g/L。TUNEL试剂盒为Roche公司产品，NOS和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)测定试剂盒购自南京建成生物工程公司，BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司。
2 实验方法
2.1 分组及给药
将大鼠随机分为4组：假手术组(A组)、缺血/再灌注模型组(B组)、芪丹通脉片＋缺血/再灌注Ⅰ组(C组)、芪丹通脉片＋缺血/再灌注Ⅱ组(D组)。A、B组给予生理盐水[10 mL/(kg·d)]灌胃，C、D组分别给予芪丹通脉片浸膏混悬液1.08 g/kg和3.24 g/kg灌胃[10 mL/(kg·d)]，均连续灌胃6 d。第7日，灌胃完成30 min后进行造模。
2.2 心肌缺血/再灌注大鼠模型的制备
参考文献
[3]方法。雄性SD大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30 g/L(45 mg/kg)麻醉。经颈部正中切口，插入气管套管，行呼气末正压通气(空气通气量20 mL/kg，频率48～50次/min)。经右颈动脉插入左心导管以测心功能参数。标准导联Ⅱ记录心电图(RM6200多导生理记录仪，成都仪器设备厂)。在胸骨左侧约0.5 cm处从第4肋纵行切口开胸，剪开心包，暴露心脏，以左冠状动脉主干为标志，在左心耳根部下方2 mm处用无创小圆针穿过左冠状动脉左降支根部下方的心肌表层，穿5-0线，将缝合线穿过小硅胶管后备用；待心电图恢复稳定，10 min后记录正常参数。在硅胶管远端的收紧缝合线至硅胶管，形成弓状并固定，以阻断左前降支阻断血流造成缺血，以心电图ST段和(或)T波抬高或降低等心肌缺血波形为结扎成功指标，缺血40 min，松解并除去硅胶管和多余缝合线，恢复左冠状动脉前降支，实现再灌注，逐层缝合胸壁，恢复自主呼吸。A组动物开胸，冠状动脉下穿线，但不结扎。 2.3 TUNEL法测定心肌细胞凋亡
再灌注结束后迅速剪下心脏，置于冰的PBS中洗净残血；分离左心室前壁缺血边缘区，于4%多聚甲醛中固定12 h，石蜡包埋。检测前对石蜡切片进行微波修复，标记前用DNA酶处理切片做阳性对照。在染色过程中用PBS代替TdT反应液，其余同说明书操作，作为阴性对照。
2.4 心肌组织中一氧化氮合酶活性的测定
实验完毕，摘除部分结扎线以下，置于冰的生理盐水中冲洗，除去血液，滤纸拭干，立即入液氮12 h后，转至-70 ℃存放。分析天平称取0.1 g左心室心肌组织，用生理盐水制备成10%的组织匀浆，倒入离心管中，3 000 r/min离心10 min，取上清液，用NOS测定试剂盒(化学比色法)测定大鼠心肌组织中总NOS活性和iNOS活性，NOS与iNOS之差为结构型一氧化氮合酶(constrictive nitric oxide synthase，cNOS)的活性。BCA蛋白定量试剂盒(Pierce，UK)进行蛋白定量。
2.5 统计学方法
数据均以x±s表示，应用SPSS10.0软件进行数据统计。同组前后使用配对t检验，组间比较应用方差分析。
3 结果
3.1 芪丹通脉片对缺血/再灌注损伤大鼠心肌一氧化氮合酶的影响
(见表1)表1 芪丹通脉片对缺血/再灌注损伤大鼠心肌NOS的影响(略)注：共30只大鼠，其中24只完成实验，有6只因未完成全部实验过程被排除；与A组比较，#P&<0.05，##P&<0.01；与B组比较，*P&<0.05，**P&<0.01
3.2 芪丹通脉片对缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响
TUNEL染色结果显示，凋亡心肌细胞胞体缩小，染色不均，细胞核被明显染成棕红色。B组心肌细胞凋亡指数为(21.3±4.2)%，芪丹通脉片(1.08 g/kg，3.24 g/kg)作用后分别为(14.3±3.8)%和(10.6±2.0)%，与B组比较，芪丹通脉片能够减少心肌细胞的凋亡指数，差异有统计学意义(P&<0.05，P&<0.01)。
转贴于 4 讨论
凋亡是导致缺血/再灌注损伤心肌细胞丢失的重要病理形式之一。虽然缺血和再灌注过程与心肌细胞凋亡发生的相关性还存在争论，但ATP在缺血期的缺少和再灌注期间恢复的变化特点与凋亡的能量依赖的特征为再灌注中凋亡的存在提供了直接证据[4]。目前，再灌注导致心肌细胞凋亡的机制尚不清楚，但大量实验结果显示，通过预处理或后处理策略减少再灌注心肌细胞的凋亡有助于心肌功能恢复。在心肌细胞中，多种效应分子参与抗凋亡过程，其中，NO在抗凋亡过程中发挥重要作用[5]。
缺血/再灌注过程中，NO具有双重生物效应，既可以表现为促凋亡效应，也表现为抗凋亡结果。这种作用特点与NO的来源、释放的量以及靶组织的状态等多种调控环节相关。内源性NO是由细胞内L-精氨酸在NOS作用下形成的。心肌中的NOS是NO的限速酶，其同功酶的活性影响着NO的来源和心肌组织中NO的水平。当抑制NOS的活性时，心肌中凋亡细胞明显增加，并增加Caspase-3的活性。
作为NO产生的限速酶，NOS包括iNOS和神经型(neurinal nitric oxide synthase，nNOS)，与内皮型NOS(endotheliale nitric oxide synthase，eNOS)组成cNOS。心肌中的cNOS主要分布于血管内皮细胞，依赖于Ca2+/钙调蛋白的活化，心肌中cNOS的活性主要由eNOS活性决定；iNOS主要源于巨噬细胞、心肌细胞和内皮细胞，由内毒素、细胞因子等诱导活化。NOS催化活性的调控是内源性NO生物合成的主要机制，其调控可发生在转录、翻译和翻译后修饰3个水平，其中翻译后修饰是调节cNOS活性的主要方式。cNOS降低和/或iNOS升高是心肌缺血/再灌注损伤的重要机制。
有研究表明，再灌注过程中，NOS的调控和活性改变表现为动态变化：缺血1 h再灌注0.5 h后cNOS的活性开始升高， 2～6 h最高，12 h后下降；而iNOS再灌注2 h后逐步升高，12 h～3 d活性达到高峰[6]。另一项研究显示，缺血60 min再灌注120 min兔心肌再灌注早期(30 min)eNOS mRNA水平下降，而120 min则回复至接近正常水平，eNOS基因表达的下降可能与eNOS启动子活性降低而使其转录速度减慢、eNOS mRNA稳定性降低等因素有关；但未发现iNOS mRNA的改变，认为在2 h时NO主要源于eNOS的调控机制[7]。在胰岛素抑制缺血/再灌注损伤的信号通路机制中进一步证实了eNOS活化对心肌保护性意义。
芪丹通脉片能够提高缺血/再灌注犬血浆中NO的水平[4]，具有保护血管内皮细胞[6]、增加动脉壁eNOS mRNA表达[1]的作用。本实验结果表明，再灌注组的NOS、iNOS活性明显高于假手术组，而cNOS的活性低于假手术组；不同剂量芪丹通脉片处理组再灌注后心肌组织中cNOS的活性均有增高(P&<0.05， P&<0.01)，较高剂量的芪丹通脉片处理显著降低再灌注心肌组织中iNOS活性(P&<0.01)。
我们的实验研究中，模型组iNOS增加和cNOS降低，反映了再灌注4 h时NOS的活性状态，但cNOS活性未恢复到接近正常水平；另外，虽然iNOS和cNOS活性显著改变，而在模型组之间的NOS活性没有显著差异，可能与iNOS与eNOS在该阶段的变化所呈现相反的变化趋势有关。
综上，芪丹通脉片干预能够抑制缺血/再灌注所致的心肌损伤，这种保护机制可能与该药预处理后抑制再灌注所致的iNOS活性、增加cNOS活性有关。虽然还不清楚芪丹通脉片如何影响NOS系统活性，但通过调控NOS活性改变心肌中NO的来源以及心肌组织和血清中NO的水平可能是芪丹通脉片抑制缺血/再灌注心肌细胞凋亡的机制之一。
参考文献
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