作者：安晏，陆兔林，马新飞，殷放宙
【摘要】 目的 对安脉颗粒提取工艺进行研究。方法 采用正交设计试验法，以绿原酸及肉桂酸为指标，选取L9(34)正交表，考察乙醇浓度、乙醇用量、提取次数、提取时间等工艺参数对绿原酸及肉桂酸含量的影响。结果 以饮片投料，加9倍量的70%乙醇，回流提取2次，每次1.0 h为最佳工艺。结论 该工艺稳定可靠，可用于生产。
【关键词】 安脉颗粒；绿原酸；肉桂酸；正交试验；高效液相色谱法
安脉颗粒是由金银花、玄参、党参、太子参等经提取加工制成的中药复方制剂，具有活血化瘀、养阴通络的功效，临床上用于血栓闭塞性脉管炎、静脉血栓形成、动脉硬化性闭塞症、脑血栓形成及后遗症等。为保证安脉颗粒提取工艺的科学合理，有利于患者服用，本试验以绿原酸、肉桂酸为考察指标，采用正交试验设计法对安脉颗粒醇提取工艺进行研究，得出最佳工艺。
1 仪器与试药
Agilent 1100型高效液相色谱系统(安捷伦科技有限公司)；CP225D微量天平(德国Sartorius)；KQ-500E型医用超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)。
绿原酸(中国药品生物制品检定所，批号110753-200212)；肉桂酸(中国药品生物制品检定所，批号110786-200403)。乙腈、甲醇为色谱纯，其余所有试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 正交试验设计
按比例称取金银花6 g，玄参6 g，党参6 g，太子参4 g，根据相应的因素水平表(见表1)提取，合并提取液，浓缩成稠膏，取样，测定绿原酸、肉桂酸含量。
2.2 绿原酸含量测定
2.2.1 色谱条件
Kromasil?-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液(12∶88)，流速：1.0 mL/min，
检测波长327 nm[1]，理论塔板数不低于1 500。表1 提取因素水平表（略）
2.2.2 对照品溶液的制备
精密称定绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得(10 ℃以下保存)。
2.2.3 供试品溶液的制备
精密吸取醇提样品液2 mL，加蒸馏水稀释至25 mL，离心，取上清液，供测定用。其余50%、60%、70%乙醇回流提取液各取3份，分别精密吸取2 mL，加30%甲醇稀释至25 mL，离心，取上清液，供测定用。
2.2.4 供试品的测定
精密量取上述对照品和各供试品溶液，注入液相色谱仪，测定并计算含量。色谱图见图1。
2.3 肉桂酸含量测定
2.3.1 色谱条件
Kromasil?-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，甲醇-0.1%磷酸溶液(54∶46)为流动相，检测波长为278 nm[2]，理论塔板数不低于1 500。
2.3.2 对照品溶液的制备
精密称定肉桂酸对照品适量，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，摇匀，即得。
2.3.3 供试品溶液的制备
精密吸取水提样品液2 mL，加蒸馏水稀释至25 mL，离心，取上清液，供测定用。其余50%、60%、70%乙醇回流提取液各取3份，分别精密吸取10 mL，加50%甲醇稀释至25 mL，离心，取上清液，供测定用。
2.3.4 供试品的测定
精密量取上述对照品和各供试品溶液，注入液相色谱仪，测定并计算含量。色谱图见图1。
2.4 数据处理
用多指标试验全概率法[3]进行数据处理。设Bi为第i号试验，Aj为第j个指标。i＝1，2……n；j＝1，2……k；且A1，A2……An互不相容，又设各指标的重要程度之比为A1∶A2∶……∶Ak＝m1∶m2∶……∶mk，则
P(Aj)＝mj/N，j＝1，2……k [1]
以Xij表示第j个指标下的第i个测定值，以Sj表示第j个指标下各次(n次)试验结果的和，即：
Sj＝ Xij i＝1，2……n，j＝1，2……k，则
P(B1/A1)＝Xij/Sj [2]
于是全概率公式为：
P(Bi ＝∑P(Aj)P(Bi/Ai) i＝1，2……n [3]
[3]式即为同时兼顾各指标综合效应的全概率公式。本例由于2个指标同等重要，互不相容，为方便起见，可按下式计算同时兼顾各指标综合效应的全概率公式，结果见表2。
P(Bi)＝P(Bi/A1)＋P(Bi/A2) i＝1，2……n
2.5 结果分析
正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。表2 L9(34)提取正交试验结果(略)表3 综合得分方差分析(略)注：F0.01(2，2)=99.00，F0.05(2，2)=19.00
表3表明，B、C因素不同水平之间有显著性差异，结合Ki值，其最佳的因素水平为A3B3C2D1。即最佳醇提工艺为以药材饮片投料，加9倍量的70%乙醇，回流提取2次，每次1.0 h。
2.6 提取工艺验证
按比例称取药材，共3批。以上述最佳醇提工艺考察并验证最佳工艺，样品处理及测定方法同上。分别测定绿原酸和肉桂酸的含量(见表4)。试验结果显示：优化提取的结果与正交表中的最优水平相接近，说明本研究所确定的工艺合理可行，可操作性强。表4 水提取最佳工艺验证试验结果(略)
3 讨论
本处方中有多味药材，其制剂工艺的评价如采用单一指标则代表性较差，用不同种类的成分作为评价指标其结果有较广泛的代表性。但由于成分含量不在同一数量级，直接累加则使数量级大的对结果的贡献大，而小的则贡献小，不符合组方原则及治则。通过概率转化可使不同量纲及不同数量级的数据整齐化，且包含了原始数据的可比信息，可直接累加。
从表3可知，因素B对试验结果影响极显著(P&<0.01)，因素C对结果影响显著(P&<0.05)，而因素A对试验结果影响不显著。根据正交试验绿原酸、肉桂酸提取率可见，样品中绿原酸、肉桂酸的含量会因乙醇用量的增加而明显升高，因此选择9倍量的溶剂。综合绿原酸、肉桂酸提取率，选择提取2次为最佳条件。
在流动相的选择中，经反复试验摸索，选择酸性流动相，因绿原酸、肉桂酸为有机酸，酸性可抑制其电离，出峰时间早，峰形稳定，分离度好。
笔者在正交试验的基础上对提取工艺进行了试验考察，优化提取的结果与正交表中的最优水平一致，可以作为安脉颗粒提取工艺的
【参考文献】
1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社，2005.153.
[2] 马 柯.高效液相色谱法测定清咽颗粒中绿原酸的含量[J].中南药学， 2006，4(6)：452.
[3] 倪水兴，彭图婉，曾 译.多指标试验全概率公试评分法研究槐米炭炮制工艺[J].中国药科大学学报，1995，26(6)：259.