【摘要】 目的 比较不同组合穴位贴敷类风关巴布剂对牛Ⅱ型胶原诱导关节炎(CIA)大鼠滑膜细胞核转录因子-κβ(NF-κβ)表达的影响。方法 大鼠背部5处皮内注射牛Ⅱ型胶原诱导大鼠关节炎，观察以雷公藤为主的中药类风关巴布剂不同组合穴位贴敷对模型大鼠免疫组化指标NF-κβ计分，以及滑膜细胞上清液的白细胞介素-1β(IL-1β)与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响。结果 类风关巴布剂治疗后，各穴位贴敷组大鼠的NF-κβ计分较模型组降低， 其中系统组(远近配穴)最接近正常组；各组滑膜浸液中IL-1β、TNF-α浓度降低。结论 类风关巴布剂穴位贴敷能够降低CIA大鼠滑膜细胞的NF-κβ的蛋白表达，并降低相关细胞因子的浓度，抑制正反馈效应；远近配穴可能通过标本兼治，多靶点起效，使其整体疗效优于单纯远道取穴或局部取穴。
【关键词】 关节炎，类风关巴布剂；大鼠；核转录因子-κβ；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-1β
类风湿关节炎(RA)是慢性全身性自身免疫性疾病，其病理基础为关节滑膜的过度增生，诱导异常增生的滑膜组织发生凋亡可能成为治疗RA的有效途径。滑膜的增生与凋亡之间的平衡受多种因素的制约，细胞因子是其因素之一。在众多细胞因子中，肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β扮演着重要的角色。研究表明，TNF-α抑制细胞发生凋亡的机制受核转录因子-κβ(Nuclear factor-κβ，NF-κβ)的调控[1]， Yamasaki等[2]研究认为NF-κβ可能是治疗RA的目标分子。本实验通过对牛Ⅱ型胶原(BcⅡ)诱导关节炎(CIA)大鼠不同组合穴位贴敷类风关巴布剂，观察其对大鼠滑膜细胞NF-κβ表达的影响，并初步探讨经络腧穴在其中的作用。
1 实验材料
1.1 动物
Wistar大鼠，清洁级健康雄性，80只，体重(120±15)g，购
于上海斯莱克实验动物有限责任公司，正常饲养。
1.2 药物与试剂
雷公藤、白花蛇舌草、乳香、没药；BcⅡ，Chondrex公司(美国)；完全弗氏佐剂，Sigma公司(美国)；IL-1βELISA kit购于Biosource公司(美国)；TNF-α ELISA kit购于Biosource公司(美国)；NF-κβ购于santa cruz Biotechnology，inc(美国)；多聚赖氨酸玻片100张，EiVision＋PolymerHRP(Ms/Rb) IHC Kit 6 mL。
1.3 仪器
显微镜OLYMPUS(日本)，低温高速离心机BECKMEN(美国)，酶标仪Bio-rad680(美国)。
2 实验方法
2.1 类风关巴布剂的组成及制作方法
雷公藤、白花蛇舌草、乳香、没药等，共12味，按固定剂量配伍(其中雷公藤占总药量的28%)，晒干，研粉，过20目筛，用80%乙醇渗漉提取，然后过滤取液，经低温低压(50 ℃，-0.8个大气压)蒸馏去乙醇后得浸膏。将浸膏按一定比例加入事先配制的巴布剂基质(主要成分明胶、甘油、聚丙烯酸钠等)中，并加入0.5%的促渗剂(氮酮)、一定比例的乳化剂及防腐剂等，充分溶合，均匀涂布于无纺布上，覆盖聚乙烯薄膜，切成3 cm×3 cm的方块(重量１ g)，密封包装，阴凉处储存备用。
2.2 造模和分组
随机从100只大鼠中选出10只为正常对照，其余90只用于造模，参照文献[3]方法配制成Ⅱ型胶原乳剂。具体方法为：在无菌条件下，用0.1 mol/L冰醋酸充分溶解BcⅡ，浓度为4 mg/mL，置4 ℃冰箱过夜后，与弗氏完全佐剂等体积混合、振荡乳化，制成BcⅡ乳剂(即每0.5 mL含1 mg BcⅡ)。置4 ℃冰箱保存备用。注射方法：于大鼠背部及尾根分5点行皮内注射，每点0.1 mL，总量0.5 mL(含1 mg BcⅡ型胶原)。15 d后同法分2点皮内激发注射。正常对照组予以生理盐水同法注射。初次免疫25 d后参照关节炎指数评分标准[1]对造模效果进行评估，评分达6分以上的大鼠被用于继续实验。将造模成功的大鼠随机分为4组，即类风关巴布剂局部穴位贴敷组(局部组)、类风关巴布剂远道穴位贴敷组(远道组)、类风关巴布剂系统穴位贴敷组(系统组)和模型对照组(模型组)各10只。
2.3 给药
根据临床及有关动物实验的取穴方案[4]取穴。系统组：大椎、双侧肾俞、双侧太溪，共5个穴点；远道组：大椎、双侧肾俞，共3个穴点；局部组：双侧太溪，共2个穴点。根据贴敷总面积相同(剂量相等)的原则，系统组每穴贴敷面积为0.15 cm2的圆形巴布剂(半径0.22 cm)；远道组每穴贴敷面积为0.25 cm2(半径0.28 cm)；局部组每穴贴敷面积为0.375 cm2 (半径0.35 cm)。在穴位处脱毛后贴敷，每3 d贴敷1次，共5次，每次雷公藤甲素剂量约为3.8 μg[5]。正常组和模型组模仿局部组贴敷不含药物的巴布剂基质。15 d后各组同时处死取标本。
2.4 取材
大鼠称重，用2%戊巴比妥纳腹腔麻醉，仰位固定，沿着左侧后腿膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出膝关节位中心约3 cm×3 cm的区域。沿髌骨上缘约0.3～0.4 cm处向下切割至股骨，再分别沿髌骨两侧向下分离至胫骨，此时即打开了膝关节腔，可见由髌骨下极向下延续有一层平滑光亮呈浅淡黄色的滑膜组织。用眼科直镊轻轻夹住其中央，用眼科剪完整剪下，置10%的中性甲醛中固定，用于检测NF-κβ的免疫组织化学染色。同法取右侧滑膜，滑膜取出之后，用生理盐水1 mL冲洗关节腔，收集关节腔液和关节滑膜组织，用于IL-1β、TNF-α的检测。
2.5 检测指标
2.5.1 细胞因子的检测
IL-1β、TNF-α活性测定采用ELISA法，按照所附说明书测定关节滑膜组织溶浆的活性。先加入标准品和待测样品，设置阴性对照，加入生物素结合的一抗(IL-1β、TNF-α)，37 ℃温箱孵育2 h，然后用洗涤液充分洗涤4次，向滤纸印干。加入辣根过氧化物酶标记的二抗工作液25 ℃孵育1 h，再用洗涤液充分洗涤4次，向滤纸印干。加入显色液25 ℃孵育30 min后加入终止液。上机检测吸光度值。
2.5.2 滑膜组织核转录因子-κβ的免疫组化ABC染色
准备组织切片(石蜡切片脱蜡至水，冰冻切片和细胞培养片用适当方法固定)；抗原修复(微波加热法，适用石蜡切片)，将切片置于耐高温容器中，注入抗原修复液，使切片位于液面以下。置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92～98 ℃之间并持续5 min，取出容器，室温冷却，30～50 min后降至室温。用TBS 冲洗切片4～5次，甩干，擦净，加20 μL 3% h3O2-甲醇溶液(Reagent F)，于室温湿盒中封闭30 min。取出切片，用TBS冲洗4～5次，甩干，擦净。用封闭液(Reagent B)20 μL覆盖，室温湿盒孵育30 min。用吸水纸将封闭液吸去，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗。37 ℃孵育1～2 h或4 ℃过夜。TBS冲洗4～5次，甩干，擦净。滴加生物素标记二抗(Reagent C)20 μL，室温湿盒孵育1～2 h。TBS冲洗4～5次，甩干，擦净。滴加酶标亲和素(Reagent D)20 μL，室温湿盒孵育30 min。TBS冲洗4～5次，滴加DAB工作液(Reagent E)约30 μL/片，着色后迅速(约1 min内)冲洗干净。20 μL苏木精(Reagent G)复染。冲洗干净脱水封片，镜检。
2.5.3 核转录因子-κβ积分[6]
在滑膜组织中NF-κβ表达阳性的滑膜组织细胞核呈橘黄色或棕黄色，每张切片沿滑膜组织带计算400倍视野中阳性细胞的占有率，计数3个视野，标出每个视野平均阳性细胞占有率，并按阳性细胞占有率分为5级：“0”为无阳性细胞，“+”为阳性细胞0～25%，“++”为阳性细胞25%～50%，“+++”为阳性细胞50%～75%，“++++”为阳性细胞75%～100%。0级积分为0，“+”积分为1，以此类推。
2.6 统计学方法
用SPSS11.0统计软件，若数据为正态分布总体比较采用多组单因素方差分析，组间比较用q检验(Newman- Keuls法)，否则用秩和检验的Kruskal-Wallis法和Nemenyi法，P&<0.05认为有统计学意义。
3 结果
(见表1、表2)表1 各组大鼠滑膜细胞NF-κβ的表达(略)注：与模型组比较，▲P&<0.05，▲▲P&<0.01(下同)表2 各组大鼠滑膜浸液的TNF-α、IL-1β水平比较(x±s，ng/mL)
转贴于 4 讨论
NF-κβ是1986年由Sen和Baltimore首先报道[7]，并发现B细胞核提取物中有一种核蛋白能与免疫球蛋白K轻链基因增强子κβ序列特异结合，促进了K轻链的表达，被称为NF-κβ。越来越多的证据表明，在RA发病的过程中，NF-κβ做为转录因子家族成员参与了滑膜组织的过度增生和炎症过程[8]。NF-κβ在胞浆中与其抑制亚单位Ⅰ-κβ结合而处于未活化状态，并可被TNF-α、IL-１β等不同的信号所激活，其活化则有赖于胞浆中Ⅰ-κβ的降解。在正常滑膜，NF-κβ的表达量很低[9]。在RA的滑膜中，免疫活性NF-κβ蛋白p50和p65大量表达于衬里层细胞和血管内皮细胞中[10]。NF-κβ的活化在RA早期滑膜炎症和增生的过程中起中心罪犯作用[11]。
在正常细胞构成性表达活化的NF-κβ仅见于成熟B细胞、浆细胞和某些神经元中，而其他大多数细胞的NF-κβ需在外界的刺激诱导下发生激活。许多细胞外因素可诱导NF-κβ的活化，如炎性细胞因子TNF-α、IL-1β等，但最终都通过IKK使Ⅰ-κβ降解而与NF-κβ解离，暴露NF-κβ的NLS，使NF-κβ经核孔进入核内，与DNA靶序列结合，发挥转录调控效应；而NF-κβ的活化导致了许多基因的表达，以直接或间接的方式调节机体的生理和病理反应。在此过程中，TNF-α、IL-1β等前炎细胞因子在NF-κβ作用下生成增加，它们作为外界刺激因子进一步活化NF-κβ信号通路，产生正反馈放大作用，这是NF-κβ迅速动员、反应灵敏的重要条件。然而，由于NF-κβ活化导致大量细胞因子、酶等生物活性物质的产生，它的过度活化必然导致机体的病理反应和损伤，正常细胞内NF-κβ的活化是在细胞内外通路的正、负反馈的精细调节下，使NF-κβ的活化保持在适当的水平。正、负两种反馈调节往往同时进行，NF-κβ是否处于活化状态则取决于何种调节占优势。
CIA的产生和发展与RA有着很多的相似性，二者都依赖于自身反应性T细胞和B细胞的激活，并能产生类似类风湿因子的抗体。Seetharaman等[12]在CIA大鼠的研究表明，对于Ⅰ型和Ⅱ型T细胞依赖的免疫应答而言，抗体诱导NF-κβ的活化主要导致T细胞依赖的免疫应答，抑制NF-κβ信号通路，使血清TNF-γ、IgG2a抗Ⅱ型胶原(CⅡ)抗体水平明显下降而IgG1水平不变，CD8+T细胞减少，CIA发病率及严重性明显减少和减轻。因此，本实验选用CIA大鼠为模型。
RA属于中医学“痹证”范畴，近年来，大量研究认为雷公藤对CIA大鼠有效，并有采用含雷公藤的复方中药穴位贴敷治疗CIA大鼠的研究[13]。我们将以雷公藤为主药的复方中药制剂与针灸穴位有机结合，研制类风关巴布剂，并进行了毒理、制剂学及临床的研究，在大鼠佐剂性关节炎穴位贴敷研究中，证明相同的给药剂量(贴敷面积)不同的穴位组合作用有差异，以系统组(远近配穴)最佳[14]。另据研究，雷公藤甲素可以下调CIA大鼠滑膜细胞TNF-α的表达，同时还可以有效抑制NF-κβ的表达与活性[15]。本实验中，造模后NF-κβ积分水平明显升高，治疗后各组都有所下降，以系统组最接近正常，同时治疗后各组滑膜浸液的TNF-α、IL-1β水平也有明显下降。因此，类风关巴布剂穴位贴敷能够有效打破NF-κβ与TNF-α、IL-1β之间的正反馈调节的恶性循环。
在本次实验中，除了药物的疗效外，合理用穴也是关键要素，一方面，通过经络腧穴给药对药效的放大作用来提高疗效，另外，远近配穴可能通过标本兼治，多靶点起效，使其整体疗效优于单纯远道取穴或局部取穴。
参考文献
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