作者：杨明，丁春燕，张娴，陈经宝，卢运田，唐波，朱首伦，曾星
【摘要】 目的 探讨二仙汤治疗男性更年期综合征临床疗效的个体差异与细胞色素P450 1A2(CYP1A2)酶基因单核苷酸多态性的相关性。方法 48例肾阴阳两虚证男性更年期综合征患者使用二仙汤治疗3个月，采用伊斯坦布尔Bosphorus大学心理系症状量化评分法并参考《中药新药临床研究指导原则》，对肾阴阳两虚证量化评分，用聚合酶链反应(PCR)扩增CYP1A2 G2964A基因，分析二仙汤的临床疗效与CYP1A2 G2964A酶基因单核苷酸多态性的关系。结果 治疗组与正常对照组之间基因型及等位基因分布无显著性差异，有效组32例受试者中有16例的CYP1A2 G2964A基因型为G/G(56.25%)，无效组16例受试者中有11例的CYP1A2 G2964A基因型为G/A(68.75%)。基因组间治疗前、治疗后的症状、体征评分无明显差异；基因组间肾阴阳两虚证主证、次症评分也无明显差异。结论 二仙汤治疗男性更年期综合征个体含CYP1A2 G2964A基因型为G/G有效率较高，个体含CYP1A2 G2964A基因型为G/A无效率较高。
【关键词】 二仙汤；男性更年期综合征；细胞色素P450 1A2
二仙汤是张伯讷教授20世纪50年代创建的治疗更年期综合征的方剂，经过几十年的临床观察，已经成为治疗更年期综合征的专方[1]。在临床上应用一组中药治疗同种症候相同的疾病时，对一些患者有效，但对另一些患者效果较差或无效，这是临床经常遇到的问题。为了进一步探讨这一问题，我们选用二仙汤在治疗男性更年期综合征中出现的疗效差异，结合患者个体差异与细胞色素P450 1A2(cytochrome P450 1A2，CYP1A2)酶基因单核苷酸多态性的相关性，初步探讨中药治疗中出现的不同疗效个体对药物敏感性与药物代谢酶基因多态性的关系。
1 临床研究
1.1 病例选择 治疗组患者均来自本院男科门诊，共48例肾阴阳两虚证患者，年龄35～61岁，平均53岁；对照组来自本院自愿者，共55例，年龄32～49岁，平均41岁。
1.2 入选标准
为了使患者症状诊断性筛查具有客观性，采用伊斯坦布尔Bosphorus大学心理系将症状量化的方法，对男性更年期综合征症状评分，体能症状＋血管舒缩症状≥5分、精神心理症状≥4分、性功能症状≥8分者可诊断为男性更年期综合征[2]。
男性更年期综合征肾阴阳两虚证中医诊断：根据《中药新药临床研究指导原则》，参考“肾阳虚证及肾阴虚证的临床研究指导原则”[3]明确中医诊断。主证：腰膝酸痛，畏寒肢冷，性欲减退，舌质淡黯，苔白干，脉沉细无力。次证：精神不振，头目眩晕，耳鸣，梦多易醒，脱发，夜尿频多，大便时秘时泄。按症状轻重分级，分为4级。
1.3 排除标准
①有急、慢性肝肾功能损害者和心功能损害者；②有睡眠呼吸暂停综合征者；③有红细胞增多症者；④前列腺癌、良性前列腺增生伴排尿障碍者；⑤有严重心血管疾病及脑卒中病史者。
1.4 治疗方法
使用二仙汤治疗：仙茅15 g，淫羊藿15 g，巴戟天10 g，当归10 g，知母10 g，黄柏10 g。每日1剂，水煎至150～200 mL，分2次服，12周为1个疗程。
1.5 疗效观测
总分值＝中医肾阴阳两虚证相关症状及体征分值＋男性更年期综合征相关症状及体征分值。疗效指数＝(治疗前症状评分总分值－治疗后症状评分总分值)/治疗前症状评分总分值。
1.6 疗效判定标准
有效：男性更年期综合征症状、体征好转；疗效指数≥30%。无效：男性更年期综合征症状、体征无改善；疗效指数&<30%。
2 实验研究
2.1 试剂
QIAamp DNA Blood Mini Kits，SuperMix High Fidelity，英韦创津生物有限公司。内切酶Bsp120I，内切酶DdeI，内切酶RsaI，英韦创津生物有限公司。Tris/Acetic Acid/EDTA Buffer 50×1L Bio-Rad Laboratories。DNA Ladders(50 bp)，晶美生物工程有限公司。
2.2 方法
2.2.1 DNA提取
取静脉血2 mL，经溶膜液/蛋白酶K消化，常规提取基因组DNA。
2.2.2 PCR扩增
①在各个反应管中分别加入PCR SuperMix High Fidelity 45 μL，1F、1R(10 μmol/μL)各1 μL，DNA模板各2 μL。②1 000 r/min，离心1 min，混匀。③放到PCR仪上进行PCR反应。④将1F、1R为引物扩增的PCR产物酶切。⑤DdeI酶切片段电泳，判断基因型。一次性凝胶系统下拍照，根据条带判断其基因型：若出现了464 bp、132 bp两个条带，则其为突变基因型A/A；若出现了596 bp、464 bp、132 bp三个条带，则其为杂合基因型G/A；若仅出现了596 bp一个条带，则为野生基因型G/G(见图1)。
2.3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件包建立数据库，基因分值组间比较采用方差分析，方差不齐者采用秩和检验(Wruskal-Wallis H)，计数资料组间构成比比较采用χ2检验，检验水平α＝0.05。
3 结果
所提取的DNA经过Ultrospec 4000 UV/visible Spectro- photometer测定，其纯度均在1.7～1.9之间，可用于PCR扩增反应。
3.1 CYP1A2 G2964A基因型及等位基因分布
治疗组与对照组的基因型及等位基因分布差异无显著性意义(P&>0.05)。2组间的人口学分布特征无差异(见表1)。 表1 CYP1A2 G2964A基因型及等位基因分布(略)
3.2 不同治疗效果CYP1A2 G2964A基因型及等位基因分布
治疗组疗效分为2组：有效组和无效组。有效组32例受试者中有16例的基因型为G/G(56.25%)；而无效组16例受试者中有11例的基因型为G/A(68.75%)。见表2。表2 不同治疗效果CYP1A2 G2964A基因型及等位基因分布(略)
3.3 治疗有效者CYP1A2 G2964A基因型与肾阴阳两虚证相关因素分析
参考《中药新药临床研究指导原则》，不同基因型治疗有效者治疗前、治疗后的肾阴阳两虚证主证、次症评分无明显差异(见表3)。表3 32例治疗有效组CYP1A2 G2964A的基因型与肾阴阳两虚证相关因素分析(略)
3.4 治疗有效者CYP1A2 G2964A组间症状评分
根据伊斯坦布尔Bosphorus大学心理系将症状量化的方法，二仙汤在治疗男性更年期综合征治疗前和治疗后，对体能症状＋血管舒缩症状、精神心理症状、性功能症状的评分无明显差异(见表4)。表4 32例治疗有效组CYP1A2 G2964A组间症状评分(略)
4 讨论
多态性(polymorphism)是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在的差异性称为基因(DNA)的多态性(gene polymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性(length polymorphism)。位点多态性是由于等位基因之间在特定的位点上DNA序列存在差异，也就是基因组中散在的碱基的不同，包括点突变(转换和颠换)，单个碱基的置换、缺失和插入。突变是基因多态性的一种特殊形式，单个碱基的置换又称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，SNP通常是一种二等位基因(biallelic)或二态的变异。据估计，单碱基变异的频率在1/1 000～2/1 000。SNP在基因组中数量巨大，分布频密，检测易于自动化和批量化，被认为是新一代的遗传标记。
药物的生物转化是由多种药酶催化进行的，而药酶遗传多态性是引起临床药动学特征变异、药物不良反应和治疗失败的主要原因[4]。因此，了解药酶的基因多态性是解决临床药物发挥正常药效和减少不良反应的基础，可以指导临床个体化用药。通过研究指导合理用药，来提高药物作用的有效性、安全性和经济性。
肝脏是药物代谢的主要器官，大多数药物在肝代谢，其代谢与CYP450 1A2、2A6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1HE 3A4等含量和活性有关。研究表明，诱导和抑制药物代谢酶是药物相互作用的主要机制。而遗传因素或环境因素都可造成不同个体P450基因变异，从而引起P450酶活性差异，使体内由它催化的许多代谢和效应存在着明显的差异，因此，P450基因多态性是造成不同个体药物代谢差异的基础。细胞色素P450是一种末端加氧酶，末端氧化功能使其在参与性激素(雄性性激素、雌性性激素)合成方面起着重要作用[5]；对性激素代谢，CYP1A2、CYP3A4是主要代谢酶[6]。在不同的个体，CYP1A2酶活性差异在45倍左右，其酶基因具有多态性，酶活性的改变明显影响对药物的代谢[7]。
中药是一个复杂的巨系统，无论是复方还是单方，其药效都是其中多种化学成分相互作用所产生的综合效果。这些化学成分相互协同或相互拮抗，从而产生中药的药理作用[8]。二仙汤主要功能之一是促进人体性激素生成，二仙汤在治疗男性更年期综合征中，能明显改善体能状态、心血管状态、精神心理状态及性功能，并且能改善肾阴阳两虚证主症和次症。二仙汤的主要组成中，仙茅、淫羊藿有类似性激素样作用，能改善男性更年期综合征临床症状和体征，不是直接补充性腺激素，而是通过提高肾上腺皮质网状带酶的活性，从而促进性激素的合成[9]和分泌或者直接或间接作用于垂体，通过改善垂体促性腺激素细胞的结构，来调节性腺激素的合成和分泌水平[10]。所以，我们选用检测与性腺激素以及中药代谢有关的CYP1A2基因，探讨中药治疗中出现的不同疗效个体对药物敏感性与药物代谢酶基因多态性的关系。经过临床观察统计，按照《中药新药临床研究指导原则》计算中药新药有效标准，计算出CYP1A2 G2964A G/G型有效18例，占总有效组56.25%；无效组16例，CYP1A2 G2964A G/A型占11例，达到68.75%。表明二仙汤治疗男性更年期综合征个体含CYP1A2 G2964A基因型为G/G有效率较高，个体含CYP1A2 G2964A基因型为G/A无效率较高。
【参考文献】
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[10] 徐维蓉，叶其明，马正立，等.二仙汤及其拆方对去势大鼠垂体促性腺激素细胞的影响[J].上海中医药大学学报，1994，8(2)：52－55.