作者：任凤梅，蒯玉花，张晓春，彭海燕，王明艳，章永红
【摘要】 目的 研究番荔枝内酯AS-4在体外对人肝癌细胞株HepG2生长的抑制作用。方法 设AS-4不同浓度组(6.25、12.5、25、50 μg/mL)、顺铂阳性对照组(25 μg/mL)和空白对照组，常规培养24、48 h，进行MTT比色试验和倒置相差显微镜观察。结果 AS-4可明显抑制HepG2细胞的生长，最高抑制效应达到91.68%，且有细胞毒性的时间和剂量依赖关系，48 h IC50为6.67 μg/mL。结论 番荔枝内酯AS-4在体外对人肝癌细胞株HepG2有杀伤作用，显示出较强的细胞毒活性。
【关键词】 番荔枝内酯；HepG2肝癌细胞株；四甲基偶氮唑蓝
Abstract：Objective To observe the inhibitory action of annonaceous acetogenins AS-4 on human liver cancer cell line HepG2 in vitro. Method Using different concentration of annonaceous acetagenins group (6.25， 12.5， 25， 50 μg/mL)， control group (25 μg/mL) of masculine (DDP)， control blank group， after routine culture of 24 or 48 hours， the effect of annonaceous acetogenins AS-4 on HepG2 was analyzed by colorimetry assay (MTT) and inverted phase-contrast microscope observing. Result AS-4 had the best inhibitory effect on HepG2， the highest inhibitory rate was 91.68%， and the effect was time-dosage dependent， and the 48 h IC50 was 6.67 μg/mL. Conclusion AS-4 has lethal effect on HepG2 in vitro， and shows obvious cytotoxic effect.
Key words： annonaceous acetogenins；human liver cancer cell line HepG2；MTT
番荔枝(Annona squamosa Linn.)为番荔枝科(Annonaceae)番荔枝属(Annona)植物，我国浙江、云南等省区均有栽培。为研究其生理活性成分，我们对该植物种子的化学成分进行分析，从中得到3个番荔枝内酯化合物(annonaceous acetogenins)，通过体外药物敏感试验筛选发现其中1个内酯AS-4具有很强的体外细胞毒活性。现将其抗肝癌作用的实验研究结果报道如下。
1 实验材料
1.1 药物
番荔枝内酯类化合物，为本课题组从番荔枝种子中提取分离所得，白色蜡状粉末，分子式C37H66O6。使用前以少许无水乙醇溶解，加生理盐水配制成所需浓度，乙醇终浓度不超过1%。
1.2 主要试剂和仪器
RPMI-1640(美国Gibco公司)，新生牛血清(杭州四季青生物制品公司)，二甲基亚砜(DMSO)，四甲基偶氮唑蓝(MTT，美国Sigma公司)，使用前以RPMI-1640培养液配成5 mg/mL。96孔培养板(美国CORNING公司)，微孔板式连续光谱测读仪(SPECTRA max 340 pc 384 美国分子仪器公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，CO2孵箱(日本Hirasawa公司)。
1.3 瘤株
HepG2肝癌细胞株由南京中医药大学海洋中心实验室提供。
2 实验方法
2.1 细胞培养
HepG2肝癌细胞株接种于培养瓶中，加入RPMI-1640培养液(含10%灭活新生牛血清、青霉素1×105 U/L、链霉素1×105 U/L)，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，每3～5 d传代1次，传代时用0.25%胰蛋白酶消化1 min，以培养液吹打制成细胞悬液后接种。
2.2 MTT比色试验
取对数生长期HepG2细胞(1×105个/mL)，接种于96孔培养板，190 μL/孔，每孔加入番荔枝内酯类化合物10 μL，使终浓度分别为6.25、12.5、25、50 μg/mL(简称药物组)，每种浓度设4个平行孔，另设顺铂阳性对照组(25 μg/mL)和空白对照组(即细胞悬液)。常规培养24、48 h后，于每孔中加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL继续培养4 h。终止培养后，吸弃全部上清，加入150 μL DMSO/孔，微型震荡器震荡约15 min，使结晶物充分溶解后，于微孔板式连续光谱测读仪490 nm处测定各孔吸光度OD值，调零孔只含有DMSO。
抑制率=(1－实验组平均OD值/肿瘤细胞阴性对照组平均OD)×100%。根据改进寇氏法计算半数抑制浓度(IC50)。
2.3 倒置相差显微镜观察
在MTT试验中，加MTT之前用倒置相差显微镜观察各组培养孔内细胞形态结构的变化，并摄像。
2.4 统计学方法
所有实验数据均以x±s表示，应用SPSS11.5软件进行t检验，P&<0.05为具有统计学意义。
3 实验结果
3.1 MTT比色分析
各种浓度番荔枝内酯化合物作用于HepG2细胞不同时间的抑制率(%)见表1。抑制率与浓度呈正相关，并有时间依赖性。48 h IC50为6.67 μg/mL。表1 AS-4对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响(略)注：与空白对照组比较，**P&<0.01。
3.2 形态学观察结果
在倒置相差显微镜下放大400倍，观察96孔板孔中细胞，番荔枝内酯化合物AS-4可明显抑制体外人肝癌HepG2细胞的生长。药物组细胞逐渐变圆，脱壁，细胞间接触变松，胞浆中颗粒增多，增殖变慢，细胞周围碎片增多；而空白对照组细胞呈上皮型贴壁生长，细胞轮廓清楚，细胞间接触紧密，细胞生长旺盛(见图1)。
4 讨论
番荔枝内酯类化合物是目前报道中体内外抗癌活性最强的化合物之一，从番荔枝科紫玉盘属植物Uvaria acuminata根中分离得到第1个番荔枝内酯化合物Uvaricin，并发现它对小鼠白血病细胞3PS(in vivo)有强杀伤作用。番荔枝内酯化合物的抗肿瘤作用被认为是作用于NADH氧化还原酶，抑制电子传递，从而抑制ATP的产生，ATP池的耗竭致使细胞死亡[1]。本研究表明，番荔枝内酯化合物AS-4对人肝癌细胞株HepG2有较显著的抑制作用，其48 h IC50为6.67 μg/mL，且具有剂量和时间依赖关系，最高抑制效应达80%以上，显示出较强的细胞毒活性[2]，充分说明AS-4能够抑制人肝癌细胞HepG2的生长，其抗肝癌活性及作用机制等均有待深入研究。
参考文献
[1] Morre DJ， de Cabo R， Farley C， et al. Mode of action of bullatacin， a potent antitumor acetogenin：inhibition of NADH oxidase activity of Hela and HL-60， but not liver， plasma membranes[J].Life Sci， 1995，56(5)：343－348.
[2] 司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].西安：世界图书出版西安公司，2004. 3，197.