作者：李松涛 周占宇 许广昌
【摘要】 目的 探讨β-七叶皂甙钠对视网膜病变（ROP）模型大鼠玻璃体内白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法 建立高氧诱导大鼠视网膜病变动物模型，将180只出生7 d的SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、生理盐水对照组和处理组。空白对照组空气中饲养，模型组、生理盐水对照组和处理组于氧体积分数为0.75±0.02的氧箱内饲养5 d后，将其放入空气中与空白对照组一同饲养5 d。出氧箱时，将处理组分为3个亚组，腹腔内分别注射0.5、1.5、3.0 mg/kg的β-七叶皂甙钠；生理盐水对照组腹腔内注射1.5 mg/kg生理盐水；空白组和模型组不作注射处理。处死所有17 d龄SD大鼠，穿刺抽取玻璃体液，采用酶联免疫吸附测定法分别测定各组新生大鼠玻璃体内IL-6、IL-8及VEGF的浓度。结果 模型组、生理盐水对照组和处理组玻璃体内IL-6、IL-8及VEGF浓度明显高于空白对照组，差异有显著性（F=38.71～415.39， q=3.510～52.053，P&<0.05）。处理组IL-6、IL-8及VEGF浓度明显低于模型组，差异有显著性（q=5.742～35.635，P&<0.05）。结论 玻璃体内IL-6、IL-8及VEGF浓度的增高可能在高氧诱导新生大鼠视网膜病变的发生过程中起重要作用。β-七叶皂甙钠能够降低IL-6、IL-8 及VEGF的表达，对氧诱导大鼠的视网膜病变可能具有保护作用。
【关键词】 β-七叶皂甙钠；白细胞介素6；白细胞介素8；血管内皮生长因子类；视网膜新生血管化；疾病模型，动物
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects of β-aescin on the expressions of IL-6， IL-8 and VEGF in the vitreous humor of high-oxygen-induced neonatal rat retinopathy.Methods A rat model of high-oxygen-induced retinopathy was established. This study consisted of 180 SD rats of seven-day-old， which were randomized to control group， high-oxygen-induced retinopathy model group （model group）， physiologic saline-treatment （saline group） group and treatment group. Rats in control group were bred in the air， those in the other three groups were bred in oxygen box containing （75±2）% of oxygen for five days and then bred together with those in control group in the atmosphere for five days. The rats in treatment group were then pided into three subgroups when out from the oxygen box and intraperitoneal injection （IPI） with β-aescin of different concentrations （0.5， 1.5， and 3.0 mg/kg） was given， respectively; those in saline group were IPI with 1.5 mg/kg physiologic saline. No injections were offered for control and model groups. All the 17-day-old rats were sacrificed and ocular humor was punctured and drawn off. The concentrations of VEGF， IL-6 and IL-8 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. ［ ResultsThe concentrations of IL-6， IL-8 and VEGF in vitreous humor in model， saline and treatment groups were higher than those in the control group （F=38.71－415.39，q=3.510－52.053，P&<0.05）， and IL-6， IL-8 and VEGF in treatment group were lower than those in model group， the difference being significant （q=5.742－35.635，P&<0.05）.ConclusionThe increased concentrations of IL-6， IL-8 and VEGF in vitreous humor may play an important role in the process of high-oxygen-induced retinopathy. β-aescin declines the expressions of IL-6， IL-8 and VEGF， which exerts an protection on high-oxygen-induced retinopathy.
［KEY WORDS］β-aescin; Interleukin-6; Interleukin-8; Vascular endothelial growth factors; Retinal neovascularization;Disease models， animal
视网膜病变（ROP）是以视网膜缺血和新生血管形成为主要体征的一种难治疾病，其发病机制较为复杂。实验研究显示，相对低氧诱导产生的白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、血管内皮生长因子（VEGF）具有促进新生血管生成的作用［1］。但是，在早产儿ROP中还未见相关报道，且早产儿ROP的药物治疗还处于探索阶段。有报道表明，β-七叶皂甙钠具有抗炎、改善微循环和增加耐低氧能力的作用［2］，提示其可能通过增加耐低氧能力而减少新生血管的生成。本研究旨在探讨β-七叶皂甙钠对高氧诱导新生大鼠ROP的玻璃体内IL-6、IL-8和VEGF表达的影响及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选择出生7 d的健康标准纯种SD大鼠共180只，性别不限，新生鼠未断奶，与哺乳母鼠共同饲养，系清洁级动物，均由第三军医大学实验动物中心提供。大鼠随机分为空白对照组、模型组、生理盐水对照组和处理组。
1.2 仪器与试剂
IL-6、IL-8及VEGF的ELISA试剂盒（购自深圳晶美生物工程有限公司），DG5033A酶标仪（南京华东电子集团医疗公司），β-七叶皂甙钠（湘雅制药厂生产）。
1.3 高氧诱导大鼠ROP模型制备与各组的处理
空白对照组空气中饲养；模型组的建立参照石文静等［3］的方法。处理组出氧箱时腹腔内分别注射0.5、1.5、3.0 mg/kg的β-七叶皂甙钠；生理盐水对照组出氧箱时腹腔内注射1.5 mg/kg生理盐水；空白对照模型组出氧箱时不作注射处理。
1.4 取材
各组SD大鼠在出生后第17天充分麻醉，经角膜缘后1 mm抽取玻璃体0.1 mL，所取标本置于2 mL消毒硅化管内，于－20 ℃保存。空白对照组与模型组各取2只完整眼球，100 g/L的甲醛固定高氧模型大鼠眼球，备切片及苏木精-伊红（HE）染色使用。
1.5 视网膜新生血管内皮细胞核计数
每只大鼠眼球间断取10个病理切片，计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目。计数血管内皮细胞核时仅计数与内界膜有紧密联系的血管内皮细胞核。
1.6 IL-6、IL-8及VEGF的检测
IL-6、IL-8及VEGF含量用酶联免疫吸附测定法（ELISA法）测定。记录反应后标本在450 nm波长处吸光度值，以定比稀释标准品的吸光度值为依据绘制标准曲线，根据样品吸光度值和标准曲线，算出标本中IL-6、IL-8及VEGF含量（ng/L）。
1.7 统计学方法
实验数据均以x±s表示，采用SPSS 10.0及PPMS 1.5［4］统计分析软件对数据进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 ROP模型视网膜血管增生的情况
正常对照组HE切片中未发现或仅在极少数切片中见到突破视网膜内界膜长入玻璃体的血管内皮细胞核，平均每张切片中新生血管内皮细胞核数目为（1.21±1.15）个。模型组切片中可见较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核，有些单独出现或成簇出现，平均每张切片中含新生血管内皮细胞核数目为（21.32±8.63）个。两组相比差异有显著性（t=7.304，P&<0.05）。
模型组、生理盐水对照组和处理组玻璃体内IL-6、IL-8及VEGF浓度均明显高于空白对照组，差异有显著意义（F=38.71～415.39，q=3.510～52.053，P&<0.05）。处理组IL-6、IL-8及VEGF浓度明显低于模型组，差异有显著意义（q=5.742～35.635，P&<0.05）。见表1。表1 各组SD大鼠玻璃体内IL-6、IL-8及VEGF浓度测定结果（略）
3 讨 论
研究显示，将新生大鼠置于高氧环境中，小血管发生闭塞， 形成视网膜无灌注区。移入正常氧环境中后，视网膜无灌注区发生缺血低氧，促使组织内产生大量炎前细胞因子，激发炎症反应，诱导新生血管产生［5］。现已证实，眼内微环境发生改变，可促使相关组织释放多种生长因子，导致新生血管的形成［6］，其中VEGF可能在其中发挥了主要作用。本实验研究显示，模型组玻璃体内VEGF浓度明显高于空白对照组，再次证实了VEGF在眼内新生血管性病变中的重要作用。 IL-6和IL-8属于炎前细胞因子，是由活化的T 细胞、单核巨噬细胞、纤维母细胞及某些肿瘤细胞所分泌的一种蛋白分子，是感染或外伤急性期反应的主要诱导因子。它能够调节免疫及促进上皮细胞或纤维细胞的增殖［7］。有文献报道称IL-6可由低氧所诱导，与VEGF具有某些类似的特征，可作为新生血管因子起作用［1］。另外，IL-6还可以直接诱导VEGF 的表达［8］，从而诱导新生血管产生。UEDA等［9］的研究显示，IL-8可以作为黑色素瘤的血管发生因子而促进肿瘤生长。且IL-8与炎症反应及血管生成有关［10］。本研究结果显示，模型组玻璃体内IL-6、IL-8浓度高于空白对照组。推测IL-6及IL-8在高氧诱导大鼠ROP中可能起到重要作用，两者可能共同参与了新生血管的形成。
β-七叶皂甙钠是20世纪60年代问世的一种抗渗出药物，目前主要用于脑损伤引起的软组织肿胀和慢性血肿的治疗。在ROP发生发展过程中，最重要的病理变化也是新生血管的生成与渗出，与脑低氧引起的脑组织慢性损伤有相似性。所以在本实验中，我们把β-七叶皂甙钠用于大鼠ROP模型的研究，并观察其疗效。本文结果显示，治疗组玻璃体腔VEGF和IL-6及IL-8的浓度较模型组显著降低，并随药物浓度的增加而降低。其可能的作用机制为：β-七叶皂甙钠的结构中含有7个羟基，羟基能有效地捕获自由基，减轻脂质过氧化的发生程度，减轻过氧化引起炎症反应的程度。
总之，β-七叶皂甙钠可能是通过抑制IL-6、IL-8及VEGF的生成而发挥对高氧诱导大鼠视网膜病变的保护作用，从而为治疗早产儿ROP等新生血管性疾病提供了新的方向。但β-七叶皂甙钠减少新生血管生成的具体调节机制，以及IL-6、IL-8、VEGF之间相互作用共同诱导新生血管发生的机制，尚需进行进一步研究。
参考文献
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