关于羧甲基壳聚糖促进牙周组织再生的安全性

【摘要】 目的 研究羧甲基壳聚糖在牙周局部应用中的安全性。方法将32只小鼠随机分为4组，每组8只。A组为空白对照组；B组为腹腔注射环磷酰胺阳性对照组；C、D组为羧甲基壳聚糖梯度实验组，在手术缺损区置入不同剂量的羧甲基壳聚糖。术后4周处死动物，应用彗星试验、嗜多染红细胞微核试验计算彗星尾数和微核率；同时收集牙周组织标本进行组织学观察。结果术后4周C、D组骨缺损区可见少量新骨形成，A组未见明显新骨形成；A组、C组、D组间红细胞微核率及彗星尾数差异无显著性(P&>0.05)，而B组的红细胞微核率及彗星尾数远高于A、C、D组（F=8.32、47.61，P&<0.01）。结论 局部应用羧甲基壳聚糖促进牙周组织再生安全可靠。
【关键词】 壳聚糖；牙周组织；安全性；彗星试验；微核试验
［ABSTRACT］ Objective To study the safety of topical use of N， 0Carboxymethy chitosan on periodontium. MethodsThirtytwo mice were equally randomized to four groups: group A， a blank group; group B， positive control group (intraperitoneal injection of cyclophosphamide， CTX); groups C and D， gradient experiment groups， different doses of N，0Carboxymethy chitosan were implanted into the operativedefect area. The mice were killed four weeks after the procedure. Comet assay to observe the genetic toxicity and histological study were performed. Results Newly formed bone tissue was noticed in bone defect area in groups C and D， no new bone was seen in group A. The micronucleus rate and number of comet tail in group B were much higher than that in groups A， C and D (F=8.32，47.61;P&<0.01); but no significant differences were found among groups C， D and A (P&>0.05). Conclusion Local application of N， 0Carboxymethy chitosan in stimulating the periodontal regeneration is safe and reliable.
　　［KEY WORDS］ Chitosan; Periodontium; Safety; Comet assay; Micronucleus test
　　牙周疾病是导致成年人牙齿丧失的主要病因，严重影响病人生活质量。牙周治疗的最终目标不仅要消除致病因子，更要重建因牙周病而丧失的支持组织，恢复牙周组织的生理形态和功能，因而牙槽骨的再生就显得尤为重要。理想的能引导牙槽骨再生的材料应具有良好的生物相容性，不引起免疫排斥反应和超敏反应，兼具含有钙、磷成分和引导骨再生的作用，无需手术提供骨源，能与人体骨整合或降解并诱导牙槽骨的再生和重建，同时应取材方便、价格低廉等。目前，临床上引导或诱导牙周组织再生的材料很多，如各种生长因子及骨替代用品等。但是由于来源困难、价格昂贵、致基因突变等原因使它们在临床上难以广泛应用。壳聚糖作为一种天然的生物材料，亲水性好，细胞容易贴附并有一定的骨传导性，不失为一种有发展潜力的促牙周或牙槽骨再生材料。羧甲基壳聚糖是经醚化改性后的壳聚糖，具有更高的水溶性[1]。本研究旨在探讨羧甲基壳聚糖应用于牙周局部组织的安全性，为将来羧甲基壳聚糖在临床上的安全应用提供参考依据。
　　1　　 材料与方法
　　1.1　　 试剂及仪器
　　羧甲基壳聚糖（由中国海洋大学生物实验室惠赠），环磷酰胺（山东普德药业有限公司，国药准字H14023686），20 g/L戊巴比妥钠；倒置相差显微镜（OLYMPUS，Japan），高速离心机，电泳仪，恒温水浴箱，光学显微镜。
　　1.2　　 动物分组
　　健康昆明种清洁级小鼠50只，雌雄各半，购自青岛药物检验所，合格证号：SCXK(鲁)20030010，符合实验动物质量要求。经适应性饲养1周后挑选体质量30～35 g的小鼠32只，以随机数字表法分为阴性对照组(A组)、阳性对照组(B组)、羟甲基壳聚糖小剂量组(C组)和大剂量组(D组)，每组8只。
　　1.3　　 动物模型制作
　　A、C、D组小鼠均在20 g/L戊巴比妥钠腹腔注射（45 mg/kg）麻醉下行前牙区牙槽骨缺损动物模型制作（A、C、D组制备动物模型所用的球钻直径分别为0.15、0.15、0.45 cm）[2]。术后，A组小鼠直接原位缝合，C、D组小鼠按牙槽骨缺损的大小分别置入不同量的羧甲基壳聚糖，严密缝合手术创口。B组小鼠腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg，每天1次，连续3 d[3]。
　　1.4　　 微核试验与彗星试验
　　术后4周处死各组小鼠后，立即取胸骨骨髓，常规制片，Giemsa染色，每只小鼠油镜下计数1 000个嗜多染红细胞，计算微核率[4]。同时，小鼠于处死前通过眼球取血，分离淋巴细胞完成彗星电泳，计算彗星尾数[5]。
　　1.5　　 组织切片
　　动物处死后立即取其牙齿及牙周组织块，置于40 g/L甲醛中固定，常规脱钙，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，苏木精伊红染色，光镜下观察新生牙周组织情况。
　　1.6　　 统计学分析
　　采用SPSS 13.0 及PPMS 1.5[6]统计软件对资料进行F检验。
　　2　　 结 果
　　2.1　　 动物入组情况
　　经适应性饲养与挑选，最终有32只小鼠进入本文实验。术后各组小鼠活动正常、反应灵敏，均未出现死亡。
　　2.2　　 大体观察
　　各组小鼠术后创口愈合良好，置入材料未见暴露及溢出，局部软组织充血水肿较轻，术后4周切片显示C、D组缺损处牙槽骨有少量骨组织再生，而A组几乎未观察到新生骨形成。
　　2.3　　 微核率与彗星尾数
　　术后4周， B组的红细胞微核率及彗星尾数远高于A、C、D组（F=8.32、47.61，P&<0.01），而A、C、D组之间比较差异无显著意义(P&>0.05)。见表1。
　　3　　 讨 论
　　牙周组织再生是治疗慢性牙周炎的最终治疗目标，可以有效保留患牙。目前，促进牙周组织再生的材料品种较多，但各有利弊，诸多弊端使其应用受到限制。壳聚糖作为一种来源丰富、取材方便的生物表1 羧甲基壳聚糖对小鼠嗜多染红细胞微核率及淋巴细胞彗星尾数的影响

材料，近年来受到国内外各学科的广泛重视[7]。在口腔领域的应用也逐渐受到人们的重视，很多学者都已通过实验室或动物实验证实了壳聚糖具有促进骨组织再生修复的作用，能取得良好的引导牙槽骨再生的效果[8]。PARK等[9]研究发现，壳聚糖可以阻止上皮组织根方迁移，诱导牙周组织再生。同时，壳聚糖还可促进成骨细胞增殖和分化[10]。羧甲基壳聚糖是醚化改性后的壳聚糖，来源丰富，价格低廉，理化性质稳定，已被应用于多个领域。同时，它所具有的独特的理化性质、多种生物学活性如良好的生物相容性、促进牙周膜细胞的增殖、抗菌性及增加细胞黏附等，使其在牙周组织再生方面的应用越来越受到人们的关注。根据国际标准化组织（ISO）和国家卫生部的规定，对于长期置入机体的材料必须进行相关毒性评价。本实验分别采用微核试验和彗星电泳对其遗传学毒性进行测定，以期得到比较全面的评价。
　　本实验在分组时尽量挑选体质、健康状况等各方面一致的小鼠，以减少实验误差，使结果更加精确，可重复性好。在为期30 d的实验期间，未出现动物的死亡，有效地保存了样本量。但在预实验期间，小鼠在模型制作时的死亡率高达39.8%，大多数都在手术后1 h内死亡。分析原因可能与所给予的麻醉药物剂量、全麻后体温丧失过快有关[11]。
　　小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验是评价环境理化因子对动物体细胞遗传毒性的一种常用的细胞水平的手段[5]；彗星试验可定性或定量分析单个细胞基因DNA单链断裂水平，可用于评价细胞基因损伤[4]。本实验联合采用这两种检验手段，希望能对羧甲基壳聚糖在牙周局部应用中的全身的潜在遗传毒性有一个较全面的认识。结果表明，羧甲基壳聚糖在牙周局部应用中未显示毒性，这与很多学者的有关研究结论是一致的。
　　综上所述，羧甲基壳聚糖本身所具有的多种生物活性及独特的理化性质、良好的生物安全性，使其作为一种新型的牙周再生材料成为可能，而且具有良好的发展前景。已有实验证实了其在牙周组织再生中的促进作用，但这仅限于小型缺损。由于其强度差、易塌陷、降解速率与新生组织的生成率不匹配等缺点[12]，使其在大型缺损中的应用仍需进一步进行探讨。
【参考文献】
[1]夏文水，陈洁. 甲壳素和壳聚糖的化学改性及其应用[J]. 无锡轻工业学院学报， 1994，13(2):162165.

[2]李志勇，孙建宁. 水合氯醛和戊巴比妥钠对SD大鼠麻醉效果的比较[J]. 四川动物， 2008，27(2):299302.

[3]刘静，于洪升. 低剂量辐射对环磷酰胺所致小鼠DNA及遗传物质损伤的影响[J]. 青岛大学医学院学报， 2008，44(1):4447.

[4]邢卫平，赵恒奎，姜宗荣，等. 微核及微核试验在遗传毒理学中的应用[J]. 安徽预防遗传杂志， 2002，8:317332.

[5]王培昌，张宗玉，张建. 彗星试验——一种DNA损伤水平与修复能力的测定方法[J]. 中华检验医学杂志， 2006，7(29):651652.

[6]周晓彬，纪新强，徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志， 2009，24(1):2932.

[7]李牧. 壳聚糖的性质及应用研究[J]. 科技信息， 2007，20:5254.

[8]PARKY J， LEE Y M， PARK S N， et al. Platelet derived growth factor releasing chitosan sponge for periodontal bonefegeneration[J]. Biomaterials， 2000，21(2):153159.

[9]PARK J S， CHOI S H， MOON I S， et al. Eightweek histological analysis on the effect of chitosan on surgically created onwall intrabony defect in beagle dogs[J]. J Clin Periodontal， 2003，30(5):443453.

[10]STUM P G， HAGES S M. The effect of polyNacety lucosam inoglycan (chitosan) on osteogenesis in vitra[J]. Periodontal， 1996， 67(11):1170.

[11]李建辉，邵友光. 试验大鼠麻醉方法及抢救措施[J]. 上海试验动物科学， 2002，22(3):180.

[12]SOANE R J， FRIER M， PERKINS A C， et al. Evaluation of the clearance characteristics of bioadhesive system in humans [J]. Eur J Pharm Sci， 1996，4:2331.