关于RAS阻断剂对糖尿病大鼠早期动脉粥样硬化形成影响

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　　　　　　 作者：高伟 陈作元 王修卫 李玉山

【摘要】 目的 观察血管紧张素转换酶抑制剂贝那普利(Bena)和血管紧张素Ⅱ 1 型受体拮抗剂厄贝沙坦（Irbe）对2型糖尿病（DM）大鼠早期动脉粥样硬化形成的影响， 并探讨其可能的机制。方法将40只雄性SD大鼠随机分为正常对照(NC) 组、DM组、Bena组和Irbe组，每组10只。 以喂高糖高脂饮食方法建立SD大鼠DM模型，DM组、Bena组、Irbe组给予高糖高脂饮食1个月后腹腔注射25 mg/kg链脲佐菌素；NC组给予普通饮食，注射枸橼酸缓冲液作为对照。在此基础上，Bena组给予Bena 3 mg/（kg·d）灌胃，Irbe组给予Irbe 20 mg/（kg·d）灌胃，NC组、DM组给予生理盐水灌胃。16周后测定各组大鼠总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)水平与稳态血糖（BG）、稳态胰岛素（PGI）浓度， 用酶联免疫法检测血清脂联素（APN）浓度， 用免疫组化法检测主动脉血管壁核转录因子(NFκB) 及血管细胞黏附分子1 (VCAM1) 表达水平。结果 DM组、Bena组和Irbe组TC、TG、LDLC与BG水平较NC组均显著升高(F=6.18～182.56，q=3.49～28.36，P&<0.01)，但3组间各指标比较差异无显著性(P&>0.05)。 Bena组和Irbe组血清APN浓度显著高于DM组(F=65.11，q=7.37、9.41，P&<0.01)，NFκB、VCAM1 表达水平和浸润的单核细胞数明显低于DM 组(F=37.64～255.33，q=6.01～22.41，P&<0.01)， Bena组和Irbe组主动脉内皮损伤明显轻于DM 组。而Bena组和Irbe组各检测指标比较差异无显著性（P&>0.05）。结论 Bena 和Irbe能升高DM大鼠血清APN浓度，抑制其血管壁NFκB 活化、VCAM1表达和单核细胞浸润，防止早期动脉粥样硬化形成。
【关键词】 糖尿病，2型;动脉硬化;贝那普利;厄贝沙坦
［ABSTRACT］ Objective To observe the effect of benazepril and irbesartan on early atherogenesis in rats with diabetes mellitus (DM) and explore its mechanism. Methods Forty male SD rats were equally randomized to four groups: control group (NC)， DM group， Benazepril (Bena) group and Irbesartan (Irbe) group. High fat and high glucose diet were used to establish a DM rat model. The rats in DM， Bena， and Irbe groups were fed with highglucose and high fat diet for one month， then streptozotocin (25 mg/kg) was injected intraperitoneally， to those in NC group， full diet was offered and citrate buffer was injected. Benazepril， 3 mg/(kg·d)， for Bena; Irbesartan， 20 mg/(kg·d)， for Irbe; and normal saline for NC， all the medicine were given through intragastric administration for above three groups. TC， TG， LDLC， BG and PGI were measured. The serum adiponectin level was measured using enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). Immunohistochemistry was used to analyze the expressions of NFκB and VCAM1 in aortic wall. Results The levels of TC， TG， LDLC and BG in DM， Bena and Irbe groups were markedly higher than that of NC (F=6.18-182.56，q=3.49-28.36，P&<0.01)， but the differences of the levels of those items between DM， Bena and Irbe groups were not significant (P&>0.05).The serum adiponectin level in Bena and Irbe groups was higher than that of DM group (F=65.11;q=7.37，22.41;P&<0.01)， but NFκB activation and VCAM1 expression level and the monocytes infilitrating into the intima of the aorta was significantly lower than that of DM (F=37.64-255.33，q=6.01-22.41，P&<0.01). The endothelial damage of the aorta in Bena and Irbe groups was less severe than DM. The differences of those items detected between Bena and Irbe groups were not significant (P&>0.05). Conclusion Benazepril and Irbesartan can raise the concentration of adiponectin， which represses the activation of NFκB， expression of VCAM1 and infilitration of monocytes so as to prevent early arteriosclerosis.
　　［KEY WORDS］ Diabetes mellitus， type 2; Arteriosclerosis; Benazepril; Irbesartan
　　糖尿病大血管病变是2型糖尿病（DM）最常见的慢性并发症之一，是DM致残致死的最主要原因。动脉粥样硬化(AS) 是加速DM大血管病变产生的主要因素之一，DM作为一个独立的危险因素，会加速动脉硬化的进程，而血管内皮细胞的损伤是AS发生的初始环节[1]。本研究选用与人的AS 形成过程和病理特征很相似的大鼠作模型，观察DM大鼠早期AS 形成时血清脂联素（ANP）浓度、核转录因子(NFκB) 活化程度和血管细胞黏附分子1（VCAM1）表达及内皮下浸润单核细胞数的变化，探讨抗肾素血管紧张素系统（RAS）的一线药物血管紧张素转换酶抑制剂贝那普利(Bena)和血管紧张素Ⅱ1 型受体拮抗剂厄贝沙坦(Irbe)对DM大鼠大血管早期AS形成的干预作用及其可能机制。
　　1　　 材料和方法
　　1.1　　 实验材料
　　胆固醇、胆酸钠、链脲佐菌素（STZ）均购自祁东同信生化厂，无水乙醚由青岛大学医学院附属医院提供，ANP ELISA检测试剂盒购自美国ADL公司，EliVision试剂盒购于福州迈新生物科技有限公司，兔抗大鼠NFκB、VCAM1多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。Bena由北京诺华公司提供，Irbe由赛诺非安万特公司提供。健康雄性清洁级SD 大鼠40只，由青岛大学医学院实验动物中心提供，8周龄，体质量180～220 g。标准化饲养房笼子喂养，每笼4只，自由进食饮水，每天光照12 h。
　　1.2　　 实验方法
　　1.2.1　　 动物分组及AS模型制作　　将40只大鼠，随机分为正常对照(NC) 组、DM组、Bena组和Irbe组，每组10只。用高糖高脂饮食法制作糖尿病大鼠AS模型[2]：给予DM组、Bena组、Irbe组喂食高糖高脂饲料，饮用120 g/L果糖水， 1个月后腹腔注射25 mg/kg STZ(以pH 4.2 的0.1 mol/L 枸橼酸缓冲液配制)，NC组给予普通饮食，注射枸橼酸缓冲液作为对照；在此基础上，Bena组给予Bean 3 mg/（kg·d）灌胃，Irbe组给予Irbe 20 mg/（kg·d）灌胃，NC组、DM组给予生理盐水灌胃，早晚各灌1次。所有大鼠均分笼按清洁级动物饲养，整个实验周期为16周。1只DM组大鼠因神经病变死亡，其他大鼠一般状况良好。
　　1.2.2　　 血清检测指标和方法　　 实验结束时经左心取空腹血标本，离心（3 000 r/min）10 min，在全自动生化分析仪上测定各组稳态血糖（BG）、稳态胰岛素（PGI）浓度与总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)水平。BG测定采用葡萄糖氧化酶法，PGI测定采用CIS放免试剂盒(法国，竞争法)。 经大鼠内眦静脉采集静脉血3 mL，室温下静置3 h，待血液凝固以后再离心(4 500 r/min)10 min，取上清液按照试剂盒说明检测血清ANP浓度。
　　1.2.3　　 组织形态学观察　　 大鼠用10 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，左胸切口，经左心室用8.5 g/L氯化钠灌洗，至损伤的右心耳流出液清亮为止。立即取胸主动脉，剪取同一部位约0.5 cm 长血管段固定于40 g/L缓冲甲醛液中过夜，石蜡包埋，横断面行4 μm厚连续切片，苏木精伊红染色，观察组织形态学改变。
　　1.2.4　　 NFκB和VCAM1表达检测　　 采用免疫组化染色法。 取病变部位血管等距切分4～5段， 以40 g/L中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋。血管标本横截面连续切片，厚度4 μm， 间隔100 μm再次切片，共切3个层面。采用EliVision法分别进行NFκB、VCAM1免疫组化染色：体积分数0.03过氧化氢灭活酶，微波修复，一抗稀释度均为1∶150，室温孵育1 h，DAB显色，苏木精复染。NFκB抗体以血管内皮细胞核内出现棕黄色颗粒物质为阳性，VCAM1以细胞膜和细胞质黄染为阳性。高倍镜下计数同一切片内全部阳性细胞及内皮细胞数，以阳性细胞占内皮细胞百分比表示NFκB与VCAM1表达的阳性率。
　　1.3　　 统计学处理
　　本文计量资料均以±s表示， 多组比较采用方差分析，两两比较采用q检验。使用SPSS 11.0及PPMS 1.5统计学软件[3]进行数据处理。
　　2　　 结果
　　2.1　　 各组血清指标检测结果比较
　　DM组、Bena组和Irbe组TC、TG、LDLC与BG水平较NC组显著升高(F=6.18～182.56，q=3.49～28.36，P&<0.01)，但3组间各指标比较差异无显著性 (P&>0.05)。DM组APN浓度明显低于NC组（F=65.11，q=19.47，P&<0.01），Bena组和Irbe组血清APN浓度显著高于DM组(q=7.37、9.41，P&<0.01)。而Bena组和Irbe组各检测指标比较差异无显著性（P&>0.05）。见表1。
　　2.2　　 各组组织形态学改变比较
　　NC组大鼠主动脉血管内膜光滑，镜下可见内皮细胞完整，单层紧贴内弹力板，中膜厚度均一，主要为收缩型平滑肌细胞。DM组大鼠主动脉管壁可 表1 各组动物血清指标检测结果比较见有少量黄色脂样斑块向管腔凸出，主要分布于近主动脉弓处，呈片状分布，为局灶性；镜下见内皮细胞体积增大，部分脱落，连接间隙增大，内皮表面黏附较多单核细胞，内膜有很多单核细胞浸润，并可观察到巨噬细胞和脂肪空泡，胞质中线粒体肿胀，中膜可见合成型平滑肌细胞。Bena组和Irbe组病变与DM组相似，但程度较轻，内膜较完整平坦，内皮黏附及浸润于内膜的单核细胞明显少于DM 组，内膜增厚明显轻于DM组，但两组间无明显差别。
　　2.3　　 各组免疫组化观察指标的比较
　　NC组仅见较少的棕黄色颗粒状阳性染色物质；DM组可见大量的棕黄色颗粒状阳性染色物质，部分融合成片，阳性染色百分比明显高于NC组；Bena组和Irbe组棕黄色颗粒状阳性染色物质百分比明显低于DM组，但高于NC组。
　　Bena组和Irbe组NFκB阳性细胞率低于DM组(F=37.64，q=9.08、7.58，P&<0.01），高于NC组（q=6.01、7.55，P&<0.01）；Bena组和Irbe组VCAM1阳性细胞率明显低于DM组（F=255.33，q=20.21、21.03，P&<0.01），明显高于NC组（q=19.44、18.58，P&<0.01）；浸润于内膜的单核细胞数Bena组和Irbe组明显少于DM组（F=176.84，q=22.41、19.82，P&<0.01），但多于NC组（q=9.69、12.36，P&<0.01）。Bena组和Irbe组间各指标比较差异无显著性（q=0.85～2.67，P&>0.05）。见表2。 表2　　 各组NFκB、VCAM1阳性细胞率和单核细胞数比较
　　3　　 讨论　　
　　 糖尿病血管病变的病理改变主要是AS，与非糖尿病血管病变相比，其病理改变重，发病年龄轻，进展快。RAS系统参与了AS的发病过程，其中，AngⅡ通过破坏内皮功能，诱导炎症反应，促进平滑肌细胞的增殖和迁移，促进低密度脂蛋白胆固醇氧化和转移，影响纤溶等机制，参与AS发生和发展。APN是近年来发现的脂肪细胞因子，是人类脂肪组织中含量最丰富的转录物质之一。研究表明， APN可通过抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化、修复损伤的内皮起到抗AS的作用。临床研究发现，APN水平下降是促使AS发生发展的重要因素[4，5]。NFκB是一种广泛存在于细胞中的多显性转录因子，它调控着细胞黏附分子、细胞因子、生长因子和免疫受体等基因转录[6，7]，可能是AS发生的始动机制之一。在血管内皮早期AS 病变发生过程中，NFκB 的激活是最早发生的[8，9]。VCAM1可促进单核细胞在血管内皮的聚集、黏附、迁移进入内皮下层，摄取脂质转化为泡沫细胞[10]。

AS具有炎症的基本特征，有变质、渗出和增生等过程， 启动阶段是各种危险因素对血管内皮的损伤[11]。DM伴随的高糖血症、高脂血症、高胰岛素血症使机体氧化能力增强，从而损伤血管内皮细胞。在内皮细胞被激活后，通过NFκB 使黏附分子如VCAM1、E选择素及ICAM1 的mRNA 表达增加，从而使更多的单核细胞黏附于内皮细胞表面， 形成动脉粥样斑块， 这是血管性疾病发生发展的关键性步骤。APN可抑制抵抗素诱导的VCAM1的表达[12]，抑制炎症刺激因子对内皮细胞的上述调控过程，从而减少单核细胞向主动脉内皮细胞的黏附。体外研究显示， APN还可以通过调节热休克蛋白90 (HSP90) 而促进内皮型一氧化氮合酶(eNOS) 的活性， 使一氧化氮(NO) 生成增加， 从而起到保护血管内皮的作用[13]。
　　本实验采用高糖高脂饮食制作SD 大鼠糖尿病模型，形态学观察显示，DM 组大鼠主动脉内皮受损明显，大量的单核细胞黏附及浸润于内膜，血管平滑肌细胞(VSMCs) 增生，这些都是早期AS 形成的特征。BG与血脂水平检测显示，BG显著升高伴胰岛素敏感性降低，说明DM模型制作成功[2]。DM 组、Bena组 和Irbe 组血清TC、TG、LDLC水平较NC组均显著升高，但3组间血清TC、TG、LDLC与BG水平差异无显著性，说明Bena 和Irbe 组抗AS的作用独立于血糖、血脂改变之外。DM组APN浓度明显降低，Bena组与Irbe组APN浓度较DM组则明显增高，但两组之间无显著差别。主动脉组织免疫组化检测结果显示，药物干预组血管壁NFκB 及VCAM1表达和浸润的单核细胞数明显少于DM 组，但仍高于NC组。说明Bena和Irbe能升高血清中血管保护性因子APN的水平，抑制血管内皮细胞中NFκB及VCAM1的活化，这可能是其抗AS的机制之一。两类药物均能有效地抑制心肌细胞肥大，抑制血管平滑肌细胞增生，抑制间质胶原蛋白的合成，抑制心肌细胞的凋亡，拮抗交感神经、儿茶酚胺及内皮素等神经内分泌系统，扩张外周血管，减低心脏前后负荷，改善靶器官供血。RAS 与早期AS 形成有密切的关系，Bena和Irbe在不同环节抑制RAS，两者抗AS 机制可能有所不同，对于不同动物、不同剂量和不同给药方式其效果可能有所差别，这些还需进一步研究。RAS 与AS 关系和发病机制的进一步明确，将会为AS 防治提供新的策略。
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