作者：刘芳 邢晓明 李玉军 赵洁
【摘要】 目的 研究葡萄糖调节蛋白78（Grp78）在结直肠腺癌组织中表达及其与临床病理特征的关系。方法应用免疫组织化学PV法检测 87例结直肠腺癌组织（其中18例同时具有腺瘤组织）及配对正常黏膜组织Grp78的表达。结果 结直肠腺癌组织Grp78蛋白表达水平显著高于正常黏膜组织（Z=-8.140，P&<0.05）， 18例腺瘤组织中Grp78蛋白表达水平高于正常黏膜组织而低于癌组织（χ2=34.111，q=3.74～8.24，P&<0.05）。在结直肠腺癌组织中未发现性别、年龄、分化程度、淋巴结转移等因素与Grp78蛋白的表达有关（P&>0.05）。结论 Grp78在正常黏膜组织、腺瘤组织、癌组织中的表达呈逐渐增高的趋势，Grp78可能参与了结直肠腺癌的发生过程。
【关键词】 结直肠腺癌；蛋白质Grp78；免疫组织化学
［ABSTRACT］Objective To study the expression of glucose-regulated protein 78 （Grp78） in human colorectal carcinoma and its relationship with clinical and pathological features. MethodsThe expression of Grp78 was detected by immunohistochemistry PV technique in 87 colorectal carcinoma specimens， of which， 18 showed adenoma simultaneously，and in matched-pair normal mucous membrane. Results The expression of Grp78 in the cancer tissue was significantly higher than that of the normal colorectal membrane （Z=-8.140，P&<0.05）. The Grp78 expression in the 18 adenoma specimens was significantly higher than that of the normal membrane but lower than that of the cancer （χ2=34.111，q=3.74-8.24，P&<0.05）. The expression of Grp78 was not associated with gender， age， extent of differentiation， and lymph node metastasis （P&>0.05）.ConclusionThe expression of Grp78 protein shows a gradual increase tendency in the order of from normal tissue， adenoma to carcinoma. Grp78 is involved in the development of colorectal carcinoma.
［KEY WORDS］ Colorectal carcinoma; Protein; Grp78; Immunohistochemistry
葡萄糖调节蛋白78 （Grp78）又名免疫球蛋白重链结合蛋白 （Bip）， 是葡萄糖调节蛋白家族成员之一。Grp78的功能很多， 除作为分子伴侣参与蛋白质的折叠和转运外，它还是内质网上的一种应激蛋白， 在低糖、低氧、低Ca2+等应激状态下大量表达以维持内质网的稳定， 保护细胞［1，2］。近年来研究发现，Grp78在多种肿瘤组织中呈高表达，与肿瘤的发生有关［3～6］。本研究应用免疫组织化学方法检测了Grp78在结直肠腺癌组织中的表达情况，并探讨了其与结直肠腺癌临床病理特征的关系。
1 材料与方法
1.1 标本
收集青岛大学医学院附属医院病理科2005年1月～2008年4月石蜡包埋结直肠腺癌组织及其配对正常黏膜组织87例，其中18例同时具有腺瘤组织。87例病人中男60例，女27例；年龄38～78岁（＜60 岁者43例，≥60 岁者44例）。肿瘤直径＜5 cm者57例，≥5 cm者30例。病理学类型均为腺癌，参照ＷＨＯ癌细胞分化分级标准：低分化 （Ⅲ级）38例，中分化 （Ⅱ级）35例，高分化 （Ⅰ级）14例。病理切片证实无肠周淋巴结转移者50例，已发生转移者37例。所有标本均经40 g/L中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。
1.2 检测方法
采用免疫组织化学PV法，第一抗体为羊抗人Grp78（Santa-Cruz，sc-1051）多克隆抗体，工作浓度为1∶200；第二抗体为兔抗羊IgG。严格按照说明书操作，用已知Grp78阳性乳癌组织作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判断
Grp78主要表达在细胞浆内，细胞膜上也有少量表达，呈棕黄色细颗粒状。根据DAB显色结果，由两位病理医师在光学显微镜下先后观察，进行染色强度以及染色细胞比例的评分。染色强度得分标准为：完全阴性者0分，淡黄色1分，黄色2分，棕黄色3分；阳性细胞百分比评价标准为：＜5%者0分，5%～24%者1分，25%～49%者2分，50%～74%者3分，≥75%者4分。Grp78的表达指数以染色强度分数×染色细胞比例分数表示［7］。
1.4 统计学处理
采用配比（对）秩和检验（两样本Wilcoxon和多样本Friedman法）来比较各组织之间Grp78表达水平的差异，多样本之间的两两比较采用q检验。结直肠腺癌病人不同性别、分化程度、浸润深度等与Grp78表达之间的关系采用两个样本的秩和检验（两样本Mann-Whitney U法）。所有数据统
计均在SPSS 13.0软件包上进行。
2 结 果
2.1 各组织中Grp78的表达
Grp78蛋白主要在癌细胞的胞浆内表达，在正常黏膜组织中也可见少量的表达，癌组织中其表达水平（9.47±0.75，n=87）显著高于正常黏膜组织（0.78±2.47，n=87）（Z=-8.140，P&<0.05）。腺瘤组织中其表达水平（5.33±2.74，n=18）显著高于正常黏膜组织（1.00±0.84，n=18）而低于癌组织（9.56±2.09，n=18）（χ2=34.111，q=3.74～8.24，P&<0.05）。
2.2 Grp78 表达与结直肠腺癌临床病理特征关系
结直肠腺癌组织中Grp78的表达与病人的性别、年龄及肿瘤大小、浸润深度、组织学分级、有无淋巴结转移均无关（P&>0.05）。见表1。表1 Grp78蛋白表达与结直肠腺癌临床病理特征的关系（略）
3 讨 论
由于血供不足及营养条件差等原因，实体肿瘤内存在低糖、低氧及酸中毒等应激微环境，这些病理条件均可引起 Grp78 的过度表达，诱导其表达可能是癌细胞在不利生存条件下的一种防御机制。作为内质网上的一种钙结合蛋白，在应激状态下，Grp78可以直接抑制前凋亡组分的激活［8］； 还可以转移内质网腔内聚集的大量的错误折叠蛋白，维持细胞蛋白质的继续合成，从而维持内质网的钙稳态和内环境的稳定［9］。大量研究表明，Grp78的这种抗凋亡和细胞保护作用与乳癌、肺癌、胃癌等多种肿瘤的发生有关［3～6］。
本研究结果显示，在正常结直肠黏膜、腺瘤及癌组织中，Grp78的表达呈现逐渐增高的趋势，表明Grp78在结直肠腺癌的发生中起一定的作用，提示它不仅可以作为一种新的标志物指示结直肠腺癌的发生，也可以作为其治疗的靶点，为下一步的研究提供了方向。
RAUSCHERT 等［10］最新研究显示，肿瘤细胞表面表达一种新型的相对分子质量为82 000 的Grp78变异体，其抗原表位为恶性肿瘤细胞所特有，而且从胃癌病人中分离得到的IgM型单克隆抗体SAM-6可以与其特异性结合。此证据表明Grp78变异体可以引起机体免疫反应，从而可以利用其作为肿瘤免疫治疗的靶点。
本研究已证实Grp78在结直肠腺癌组织中呈过表达， 并计划在此基础上通过RNA干扰方法抑制癌细胞中Grp78的表达，以期达到治疗效果，为结直肠腺癌的基因治疗提供新思路。然而，我们未发现Grp78的表达与结直肠腺癌的分化程度、浸润深度及淋巴结转移相关，提示Grp78与结直肠腺癌的进展关系不大，此方面还有待于进一步的研究。
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