作者：杨丽 闫志勇 宋旭霞 王斌
【摘要】 目的 对从双齿围沙蚕消化道内分离出的菌株Y5进行系统鉴定。方法 通过形态学、生理学、气相色谱法、（G+C）mol%、16S rRNA基因序列测定以及系统发育分析，鉴定该细菌的种属。结果 菌株Y5为革兰阴性细菌，直杆状，无芽孢，无鞭毛，大小为（0.5～1.0）μm×（1.5～3.0）μm；生长温度范围4～40 ℃；具有嗜盐性，NaCl耐受范围10～130 g/L；氧化酶、过氧化氢酶、精氨酸双水解试验阳性，不还原硝酸盐；可利用葡糖糖、麦芽糖且为惟一碳源；精氨酸脱羧试验阳性；细胞主要脂肪酸成分C18:1ω7c为41.0%、C16:1ω7c为25.5%、C16:0为12.9%，C10:0 3-OH为7.8%。DNA的（G+C）mol%为47.5%。菌株Y5 16S rRNA基因序列与9种已确定的海单胞菌相似度为93%～97%。根据16S rRNA基因序列构建的系统发育树显示，该菌株与其他海单胞菌位于系统发育树的同一类群中。结论 该细菌属海单胞菌属，并且可能为海单胞菌属的一个新种，暂命名为沙蚕海单胞菌（M. aibuhitensis sp. nov）。
【关键词】 海单胞菌；双齿围沙蚕；16S rRNA；系统发育分析
［ABSTRACT］ Objective To identify a bacterial strain （strain Y5） isolated from the alimentary tract of Perinereis aibuhitensis Grube. MethodsThe genera of the bacterial strain （strain Y5） was identified by means of morphology， physiology， meteorological stratography， （G+C）mol%， 16S rRNA gene sequence， and phylogenetic analysis. Results Strain Y5 was Gram negative， rod shape， without germ， atrichia， and the size was （0.5-1.0）μm×（1.5-3.0）μm. It grew in temperature ranged 4-40 ℃. It was halophilous， grew in the presence of 1% to 13% （W/V） NaCl. It was positive for arginine decarboxylation test. D-glucose and maltose were utilized as sole carbon sources. The percentage of the composition was: C18:1ω7c was 41.0%， C16:1ω7c was 25.5%， C16:0 was 12.9%，and C10:0 3-OH was 7.8%.The similarity of 16S rRNA gene order of strain Y5 was 93%-97% to the nine recognized species of Marinomonas. The phylogenetic analyses showed that strain Y5 was within the species cluster comprising the genus Marinomonas. Conclusion Strain Y5 maybe a new species belongs to the genus Marinomonas， which is briefly named M. aibuhitensis sp. nov.
［KEY WORDS］ Marinomonas; Perinereis aibuhitensis Grube; 16S rRNA; Phylogenetic analysis
海单胞菌属（Marinomonas）属于γ-变形菌纲海洋螺菌目海洋螺菌科。早在1983年，VAN LANDSCHOOT和DE LEY将原交替假单胞菌科交替假单胞菌属的A.communis和A.vaga两菌进行了重新分类，将其划归海洋螺菌科，并建立了海单胞菌属［1］。到目前为止，该属已经陆续确认了9个种，分别分布于黑海、地中海、日本海、亚南极区的海水或海洋生物中。我国海域广阔，海洋生物资源种类丰富，但迄今还未发现该菌属细菌的报道。我们在研究双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis Grube）消化道菌群组成的过程中，分离出1株细菌（Y5），经过生理学、细胞脂肪酸、（G+C）mol%、16S rRNA基因序列测定以及系统发育分析，证实其属于海单胞菌属，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 主要仪器和试剂
主要仪器有 DNA扩增仪（4800型，美国PERKIN公司），紫外线透射仪（Promega公司），基因组DNA提取试剂盒（Wizard Genomic DNA Purification Kit，Promega），PCR产物纯化试剂盒（Promega），pGEM-T Easy载体（Promega）；主要试剂有Taq DNA 聚合酶、dNTPS、T4连接酶、EcoR Ⅰ等（加拿大MBI公司）。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。
1.2 Y5菌株的分离
双齿围沙蚕采集自青岛近海海岸的泥沙中。将活沙蚕用无菌海水洗净后置于无菌海水中24 h使其排泄出肠道中的代谢物，解剖分离出消化道，用棉拭子蘸取内容物接种至2216E培养基，25 ℃分离培养，获得单个菌落。
1.3 形态观察
取菌株Y5接种于2216E固体培养基和营养琼脂培养基上25 ℃ 培养24 h后，光学显微镜下观察细菌形态和革兰染色反应，电子显微镜下观察细菌的结构，并测定其大小。鞭毛染色参照文献［2］方法进行。
1.4 生理特性的测定
1.4.1 生长温度
将Y5菌株接种于无菌海水配制的2216E培养基，然后分别于4、25、35、40 ℃培养，观察其生长情况。
1.4.2 耐盐性
用无菌双蒸水代替海水配制2216E液体培养基，然后加入10～130 g/L浓度的NaCl，将菌株Y5分别接种于其中，25 ℃培养24 h后观察其生长情况，以检测菌株Y5对NaCl的耐受浓度。
1.4.3 对碳源的利用及其他生化实验
参照文献［2］方法进行。
1.5 细菌脂肪酸的测定
由军事医学科学院微生物研究所采用HP 6000气相色谱仪进行测定。
1.6 DNA的（G+C）mo1％的含量的测定
采用熔点法（T 值法）测定（G+C）mol％的含量［3］。
1.7 16S rRNA基因的PCR扩增、序列测定和系统发育分析
将菌株Y5接种于LB液体培养基中过夜培养至对数生长期，用试剂盒提取基因组DNA。参照文献［4，5］的方法设计PCR扩增引物，上游引物：5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′，下游引物5′-AGTAAGGAGGTGATCCAACCGCA-3′。PCR反应体系（50 μL）含：模板2.0 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，10×PCR缓冲液5 μL，MgCl2（25 mmol/L）5.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L each）5.0 μL，引物（10 μmol/L）各2.0 μL。扩增条件为：94 ℃ 6 min后，94 ℃预变性45 s、54 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s，30个循环后72 ℃延伸10 min。PCR产物经试剂盒纯化后与pGEM-T Easy载体连接，转化E．coli JM109，提取质粒后，送上海英骏生物技术有限公司测序。将实验所得的菌株Y5 16S rRNA基因1 532 bp的序列输入GenBank，与已收录的细菌基因序列进行BLAST比较。利用CLUSTAL X与其他相关细菌序列进行对比， MEGA（3.0）软件Kimura 2-parameter距离模型进行UPGMA分析生成系统发育树，发育树用Bootstrap法（重复数为1000）检验。
2 结果
2.1 形态与菌落特征
菌株Y5为革兰阴性菌，呈直杆状，大小约为（0.5～1.0）μm×（1.5～3.0）μm，鞭毛染色和电子显微镜下均未发现鞭毛（图1）；在2216E和营养琼脂培养基（30 g/L NaCl）平板上培养24 h后形成的菌落形态相似，均为圆形，凸起，边缘整齐，无色半透明，湿润有光泽的光滑型菌落，直径约0.5 mm，培养48 h后直径可达1.0～2.0 mm，淡黄色，扁平。
菌株Y5可在4～40 ℃范围内生长，但4、40 ℃生长缓慢；可以在10～130 g/L NaCl环境中生长，无NaCl或浓度超过140 g/L 则不生长，表明该菌具有嗜盐性。菌株Y5可利用葡萄糖、麦芽糖，分解甘露糖的能力较弱，不能利用甘露醇、乳糖、半乳糖、鼠李糖、果糖、山梨醇、棉子糖、纤维二糖、蔗糖、木糖、海藻糖、侧金盏花醇等；氧化酶、过氧化氢酶、精氨酸双水解试验阳性，不还原硝酸盐；精氨酸脱羧试验阳性，但鸟氨酸脱羧、赖氨酸脱羧阴性；另外，该菌不能液化明胶，靛基质、Tween-80水解、DNA酶、尿素酶、淀粉酶、h3S试验均阴性。见表1。表1 菌株Y5和其他海单胞菌属细菌的鉴别特征比较（略）
2.3 菌体脂肪酸含量
经气相色谱法测定，菌株Y5的主要脂肪酸成分为C18:1ω7c （41.0%）、C16:1ω7c （25.5%）、C16:0 （12.9%）、C10:0 3-OH（7.8%）。见表2。 表2 菌株Y5及相关细菌细胞主要脂肪酸组成（略）
2.4 DNA的（G+C）mo1％含量
菌株Y5 DNA的（G+C）mol%为47.5%，与其他海单胞菌基本一致。见表1。
2.516S rRNA基因序列及系统发育分析
经PCR扩增获得菌株Y5 16S rRNA基因片段的长度为1 532 bp（序列见GenBank DQ279852）。将该序列经BLAST与GenBank中已收录的细菌基因序列进行比较，结果显示与其相似性最高的几种细菌依次是海单胞菌属的M.aquamarina（97%）、M.communis（97%）、M.pontica（95%）、M.dokdonensis（95%）、M.vaga（95%）等。
选取海单胞菌属已经确认的菌种、与海单胞菌属在分类学上同属海洋螺菌科或海洋螺菌目的部分菌株，以及海单胞菌属1984年独立以前所属的交替单胞菌属（科）的部分菌株（Alteromonas macleodii，Pseudoalteromonas haloplanktis）的16S rRNA基因序列，采用UPGMA法建立了系统发生树，结果显示菌株Y5和其他已经确认的9种海单胞菌都位于系统发生树的同一独立的类群中，并且与M.aquimarina位于同一个进化枝中。
3 讨 论
1983年，VAN LANDSCHOOT和DE LEY在研究原交替假单胞菌科交替假单胞菌属的A. communis和A. vaga时发现，这两种细菌在生理、遗传学等方面均不同于该属的其他细菌，因而建立了海单胞菌属，并将这两种细菌更名为M. communis和M. vaga［1］。海单胞菌属属γ-变形菌纲海洋螺菌目海洋螺菌科，目前已经确认了9个菌种，其中M.primoryesis、 M.aquamarina、M.pontica、M.ushuaiensi、M.dokdonensis和M.polaris等6种是2003年以后才报道的，可推测该属细菌可能还有更多菌种有待发现。目前还未见有从中国本土分离出该属细菌的报道。2005年10月，我们在研究双齿围沙蚕消化道菌群组成时分离出1株细菌，经研究确认其属于海单胞菌属。
菌株Y5为革兰染色阴性直杆菌，无芽孢，其生长具有嗜盐性，且可耐受浓度达130 g/L的NaCl；氧化酶、触酶试验均阳性，能分解利用葡萄糖，不还原硝酸盐；此外，其细胞脂肪酸组成和DNA（G+C）mol%等生物学特征均与其他大多数海单胞菌基本一致。该菌的16S rRNA基因序列经BLAST与GenBank中已收录的细菌基因序列进行比较显示，与海单胞菌属的细菌相似性为95%～97%。根据该序列建立的系统发育树显示，菌株Y5与其他海单胞菌处于同一分支，由此可见，菌株Y5在分类学上应属于海单胞菌属。此外，该系统发生树还显示，所有海单胞菌都位于系统发生树的同一类群中，与海洋螺菌科其他菌属细菌的距离较近，而与交替假单胞菌的进化距离较远，从而进一步证实了VAN LANDSCHOOT等在分类学上对海单胞菌定位的正确性。
但是，菌株Y5的部分生物学性状又不同于其他海单胞菌［1］，例如，菌株Y5可分解利用的碳源、氮源的种类少，生长温度范围广（4～40 ℃），NaCl耐受程度高，尤其是该属其他细菌多是单极端鞭毛，而本文通过鞭毛染色、电子显微镜观察、动力实验等未能发现菌株Y5鞭毛的存在。此外，其16S rRNA基因序列与海单胞菌属其他细菌相似性最高为97%，这一数值在被公认的同一菌属不同菌种16S rRNA基因序列同源性鉴别范围内［6］，因此该菌株目前尚不能定种，推测其可能为海单胞菌属的未报道种。因此，综合该菌的上述生物学、遗传学性状，推测其为海单胞菌属的一个新种，暂命名为沙蚕海单胞菌（Marinomonas aibuhitensis sp. nov），目前还需要与该属的模式菌进行DNA-DNA杂交实验做进一步分析。
由于海单胞菌属细菌大多是新发菌种，海单胞菌属细菌的其他研究报道很少，其中M.mediterranea 是第一个被发现的能表达多酚氧化酶的原核生物［7］。双齿围沙蚕属于环节动物门多毛纲游走目沙蚕科，通常出现在海边潮间带的石下或海藻间。自然环境中的沙蚕主要以废水里的有机物为食，被称为“泥滩的清洁工”，由此推测其体内可能具有多种生物活性物质或特殊的微生态菌群，以帮助沙蚕抵抗外界污染环境的损害。海单胞菌菌株Y5作为双齿围沙蚕消化道的常驻菌，其生物功能、与环境和宿主的关系还有待于进一步研究，该菌株的分离为丰富我国海洋微生物物种提供了又一重要资源。
参考文献
1］VAN LANDSCHOOT A， DE LEY. Intra- and intergeneric similarities of the rRNA cistrons of Alteromonas， Marinomonas （gen nov.） and some other Gram-negative bacteria［J］. J Gen Microbiol， 1983，129:3057-3074.
［2］东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册［M］. 北京:科学出版社， 2001:354-355.
［3］MARMUR J， DOTY P. Determination of the base composition of deoxyrbanucleic acid from its thermal denaturation temperature［J］. Mol Bio1， 1962，5:109-118.
［4］闫志勇，张璇，王斌. UP-PCR结合RFLP对脑脊液标本中病原菌的检测［J］. 青岛大学医学院学报， 2003，39（1）:4-6.
［5］闫志勇，王斌，苏维奇，等. 多重半套式PCR检测细菌16S rRNA基因方法的建立［J］. 青岛大学医学院学报， 2001，37（1）:22-24.
［6］STACKEBRANDT E， GOEBEL B M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequenceanalysis in the present species definition in bacteriology［J］. Int J Syst Bacteriol， 1994，44:846-849.
［7］FRANCISCO S， PATRICIA L E， EVA F N， et al. Marinomonas mediterranea MMB-1 transposon mutagenesis: isolation of a multipotent polyphenol Oxidase Mutant［J］. J Bacteriol， 2000，182:3754-3760.
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