关于兔主动脉脱细胞血管基质的制备

　　　　　　 作者：林明山 池一凡 侯文明 孙忠东 牛兆倬 孙勇 生伟 孙龙

【摘要】 目的 研究脱细胞血管基质的制备方法。方法 采用胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法处理兔胸主动脉制备脱细胞血管基质， 标本经苏木精伊红染色光镜观察，20 g/L戊二醛固定做扫描电镜、透射电镜观察。结果 光镜下血管脱细胞组织基质中胶原纤维和弹性纤维呈网状排列，细胞已全部除去;扫描电镜观察血管脱细胞组织基质纤维结构完整，胶原纤维无断裂，呈网状和多孔状，孔径（100～150）μm ×（10～20）μm;透射电镜观察示胶原和弹性纤维无断裂，基底膜面光滑完整，无破裂。结论 胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法处理兔主动脉，可使血管细胞全部脱除，胶原纤维、弹性纤维无断裂，细胞外基质保持完好。
【关键词】 细胞外基质;主动脉；胰蛋白酶
　目前，应用组织工程技术制备血管移植材料成为血管移植手术研究的热点[1，2]。组织工程血管的制备主要包括血管支架材料的研制、体外细胞培养和种植。可以用作组织工程血管的支架材料主要有体内可降解的人工合成材料和从天然组织中制备获得的材料。人工合成材料如聚乙二醇酸(PGA)、聚丙醇酸(PLA)等，有较好的生物相容性、可塑性和可降解性，但其工艺复杂。从天然组织中制备获得的材料如血管脱细胞组织基质(ACTM)因含有特殊氨基酸序列等，可促进细胞吸附或保留分化功能，因此，作为天然生物支架材料逐渐受到人们重视[3]。本文采用酶、低渗溶液和化学除垢剂相结合的方法制备兔主动脉脱细胞血管基质，为进一步应用于临床提供依据。
　　1 材料和方法
　　1.1 实验材料
　　
　　实验动物:取健康普通家兔1只，雄性，2月龄，体质量560 g。主要仪器有:SWCJ2FB超净工作台（苏州净化仪器厂）、DDHZ300型恒温震荡器（太仓市实验设备厂）、XTU10C光学显微镜（上海豫光仪器有限公司）、JSM840扫描电镜（日本JEOL公司）、JEM1200EX透射电镜（日本JEOL公司）。试剂主要有:1.25 g/L的胰蛋白酶(Sigma公司)、体积分数0.01的Triton X100(Sigma公司)、10 g/L十二烷基硫酸钠 (SDS， Sigma公司)、磷酸盐缓冲液(Sigma公司)、Hank’s液(Sigma公司)。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 动物血管采取 家兔耳缘静脉注射空气致死，无菌条件下开胸取其胸主动脉，长8 cm，直径0.35 cm，置入培养皿中，加入Hank液冲洗干净，用眼科剪、镊剥去外层结缔组织及外膜。
　　1.2.2 细胞脱除方法 将获取的血管放入15 mL离心管中，加入含双抗的1.25 g/L的胰蛋白酶6～8 mL作用4 h，然后用PBS冲洗3次，去离子水作用12 h，体积分数0.01的Triton X100溶液作用24 h，PBS冲洗3次，去离子水作用4 h，最后采用10 g/L的SDS作用24 h，PBS冲洗3次，含双抗的Hank液冲洗4 h后保存。以上步骤均在37 ℃恒温震荡器中进行。
　　1.2.3 脱细胞血管基质的观察 将制取的脱细胞血管基质用40 g/L的甲醛固定，苏木精伊红染色，光镜观察细胞脱除情况;用20 g/L的戊二醛固定，扫描电镜、透射电镜观察细胞脱除情况及胶原纤维和弹性纤维情况。
　　2 结果
　　2.1 大体观察
　　
　　血管剥除外膜后，管壁弹性良好，管腔无塌陷，内膜面光滑完整。脱细胞处理后，血管呈乳白色，管壁无破损，管腔无塌陷。
　　2.2 光镜观察
　　
　　处理前的血管壁中有大量核蓝染的细胞存在，亮红色、波浪状平行排列的胶原纤维清晰可见。血管脱细胞组织基质中胶原纤维和弹性纤维保持原来的形态和结构，呈网状排列，其中细胞已全部被除去(图A、B)。
　　2.3 扫描电镜观察
　　
　　血管脱细胞组织基质纤维结构完整，胶原纤维无断裂，呈网状和多孔状，孔径（100～150）μm ×（10～20）μm(图C、D)。
　　2.4 透射电镜观察
　　
　　胶原、弹力纤维呈网状排列，纤维无断裂，基底膜面光滑完整，无破裂(图E、F)。
　　3 讨论
　　
　　合适的支架材料对于构建组织工程血管十分重要，脱细胞血管基质是采用动物血管，经脱细胞处理后而获得的一种生物材料，它不仅去除了血管原有的免疫原性，保持了血管的原有形态和物理性能，而且保存了细胞识别的结合位点，易于种子细胞的种植和吸附[4～6]。 目前， 脱细胞组织基质已应用于膀胱、口腔黏膜、骨等器官的重建[7～9]。1990年，WILSON等[10]应用除垢剂酶联合提取法对狗颈总动脉进行处理，制备出ACTM支架，经多步骤的脱细胞处理，组织中的可溶性蛋白及细胞成分被除去，保留下来的是具有完整外观形态和组织学及超微结构的不可溶成分，主要包括胶原、弹性蛋白、氨基葡聚糖、结构蛋白等。脱细胞的方法主要有酶消化法和去污剂法。本文采用酶、低渗溶液和化学除垢剂联合的方法，多步骤处理血管获得脱细胞血管基质:先用胰蛋白酶对血管壁中的某些基质进行溶解，破坏其细胞的完整性，然后用低渗溶液进一步导致细胞溶胀、破裂[11]。

BOOTH 等[12]仅用0.3 g/L的SDS就能将心脏瓣膜中的细胞完全除去，且胞外基质保存完好。RIEDER等[13]的研究也表明，使用1 g/L的SDS制备的脱细胞血管基质由于细胞毒性过大，细胞根本无法在上面存活。本实验采用Triton X100 和10 g/L的SDS联合脱细胞的方法，以完全脱除细胞和最大程度降低SDS的细胞毒性。本实验将Triton X100 放在SDS之前应用，是因为SDS为离子型去垢剂，脱细胞效果强，短时间内大量细胞破裂后释放的蛋白酶较多，从而引起较多的蛋白纤维损伤，影响血管的结构和力学特性，故使用柔和的非离子型去垢剂Triton X100先去除部分细胞及内在的蛋白酶，使细胞内的蛋白酶不至于短时间内大量释放，降低胶原纤维、弹力纤维的损伤；应用Triton X100，通过其上的亲水基团而溶解细胞膜，清除部分蛋白酶；最后用SDS进一步脱除细胞。实验结果证明，细胞被彻底清除，胶原纤维、弹性纤维排列正常，结构完整。血管经酶和去垢剂处理后，将细胞和可溶性蛋白质去除，保留了由无抗原的胶原、弹力纤维和糖氨聚糖组成的细胞外基质，它允许新细胞向内生长繁殖[14，15]。
　　
　　图A、B 血管脱细胞组织基质光镜观察 脱细胞组织基质中胶原纤维和弹性纤维保持原来的形态和结构，呈网状排列，细胞已全部除去（略）
　　图C、D 血管脱细胞组织基质扫描电镜观察 基质的纤维结构完整，为网状和波浪状排列（略）
　　图E、F 透射电镜观察 胶原、弹力纤维呈网状排列，纤维无断裂，基底膜面光滑完整，无破裂（略）
【参考文献】
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