作者：江磊 高洪波 徐平 李贞福 常青 郝传吉 王伟 于仁斌
【摘要】 目的 通过压力培养细胞装置研究主动脉瓣膜间质细胞在机械力作用下肌糖蛋白-C（TN-C）表达的改变，从瓣膜对机械力损伤修复角度探讨风湿性心脏瓣膜病的发病机制。方法 无菌手术获取主动脉瓣，剥除内皮层，胶原酶消化分离间质细胞，体外培养；构建产生等双轴周期性压力装置；利用机械力作用细胞后，以实时定量RT-PCR鉴定TN-C的表达；加入不同蛋白激酶阻断剂，分析参与机械力诱导TN-C的信号传导途径。结果 成功构建双轴周期性压力装置；机械力通过RhoA/ROCK途径诱导TN-C的转录，而p38MAPK、PKC和ERK途径没有参与机械力诱导TN-C的表达。结论 在风湿性瓣膜炎的发病过程中，机械力在TN-C的转录和表达中有一定作用，从而诱发瓣膜病理改变。
【关键词】 肌糖蛋白-C；机械力；风湿性心脏病；信号转导
［ABSTRACT］Objective［ To explore pathogenesis of rheumatic heart vascular diseases （RHVD） from direction of valve repair after mechanical stress injury through tenascin-C （TN-C） expression by culturing valve interstitial cells in vitro with designed strain-producing instrument under mechanical stress.［ Methods［ Aortic valves were obtained under aseptic condition， and the endothelial layer deprived. The valve interstitial cells were isolated by collagenase Ⅰ and then cultured in vitro. The equi-biaxial cyclic strain production device was developed. TN-C mRNA was measured by quantitative real-time RT-PCR after mechanical application. Signal transduction pathways induced by mechanical stress were assessed after using different protein kinase inhibitors.［ Results［ The equi-biaxial cyclic strain production device was developed successfully. Cyclic strain induced TN-C transcription through RhoA/ROCK signaling pathway other than p38 mitogen-activated protein kinase， PKC and ERK activation were found. ［ Conclusion［ In the process of rheumatic valvulitis， the mechanical power plays a certain role in TN-C transcription and expression and thus inducing pathologic changes of the valve.
［KEY WORDS］Tenascin-C; Mechanical stress; Rheumatic heart disease; Signal transduction
风湿性心脏病（简称风心病）是危害人类健康的严重疾病，其发病机制并未完全确定。传统理论认为其与A型溶血性链球菌的感染和宿主自身免疫反应有关［1］。既往研究也发现，风湿性病变的发生部位主要集中在心脏瓣膜、心肌、关节等细胞外基质（ECM）成分承受机械力最大最频繁的部位，特别是风心病瓣膜病变的发生与承担的压力高低密切相关［2］。肌糖蛋白-C（TN-C）是ECM重塑的一组重要分子，且是迄今为止能够证实的由机械信号直接调控的最重要分子之一［3］。本研究旨在探讨机械力诱导TN-C在风心病瓣膜间质细胞中表达的机制。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试剂及抗体
细胞裂解液TRIzol 购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒RNeasy mini kit和DNA酶DNase购自Qiagen公司；核酸荧光染料SYBR Green PCR Master Mix 购自Merck公司；DEPC和琼脂糖购自Sigma公司；一步法试剂盒（RT-PCR kit in one-step）购自TaKaRa公司；引物由上海生工公司合成；蛋白激酶阻断剂MEK-1 阻断剂 PD 98059 （阻断 ERK 1/2， PD）、p38MAPK阻断剂SB203580 （SB）、PKC阻断剂GF109203X （GFX）和 ROCK-Ⅰ/Ⅱ阻断剂Y27632 （Y） 购自Calbiochem公司。蛋白激酶阻断剂的使用浓度
参考文献
［4］或者依照其说明书，均为10 μmol/L。1.1.2 主要仪器和设备
高速低温冷冻离心机（美国Eppendorf公司提供），CO2细胞培养孵箱（美国Thermo Forma公司提供），倒置相差显微镜（日本Olympus公司提供），荧光实时定量RT-PCR仪（美国Stratagene公司提供）。
1.1.3 标本
临床取5例主动脉瓣先天畸形及10例风湿性心脏瓣膜病病人行瓣膜置换术后的主动脉瓣瓣膜组织，分离间质细胞并培养。
1.2 方法
1.2.1 等双轴周期性压力装置的设计和制备
仿照CHIQUET等［5］设计和制备等双轴周期性压力装置，利用我们专利的心室辅助装置（VAD）建立能够施加机械力的细胞培养设备。根据细胞黏附、解黏附情况决定硅酮膜拉伸度和VAD运作频率。
1.2.2 3D网状胶原蛋白培养系统的建立
将溶于1 g/L醋酸的胶原蛋白中性化并用冰冷0.01 mol/L PBS稀释，终浓度为150 ng/L。取100 μL无菌胶原蛋白溶液并滴于6孔细胞培养板的中央，并盖上20 mm瓶盖，室温静置4 h，使其吸附于硅酮膜上。移去瓶盖，吸取多余液体，无菌操作台内使用UV灯（254 nm，20 W，15 cm距离）照射半小时至硅酮膜干燥。每孔加入6×105个瓣膜间质细胞培养。
1.2.3 人主动脉瓣间质细胞（HAVICs）的分离与培养
手术中无菌获取主动脉瓣膜，将内皮层剥除。将间质层无菌下切成约0.5～1.0 mm3小块，用含2 g/L Ⅰ型胶原酶和1 g/L BSA的M199在37 ℃消化2 h，此过程中每20 min将组织块抽吸并吹打。200 r/min离心30 s，弃去未能消化组织。加入5倍以上体积的M199，1 500 r/min离心10 min，洗涤细胞2次。末次离心后，弃上清，重悬细胞。随后将细胞铺于细胞培养板中。培养液中加入体积分数为0.10的对应病人血清或者小牛血清。于37 ℃体积分数0.05CO2孵箱中培养。在倒置显微镜下观察细胞形态。细胞覆盖率达70%～90%后消化并按照1∶5传代。普通六孔板中，每孔置入6×105个细胞， 以作为压力培养的对照。同时，将6×105个细胞置于1 mL培养液中，滴至硅酮膜被覆胶原蛋白部位。以10%伸展度、3 Hz作用细胞。
1.2.4 总RNA提取及反转录
细胞计数后取对数生长期细胞（约106个），以1 000 r/min离心10 min后将沉淀细胞溶于1 mL TRIzol中。室温作用5 min。按照每1 mL TRIzol 在Eppendorf 管中加入 0.2 mL 氯仿，剧烈振荡后放置于室温作用2～3 min。4 ℃ 下以12 000 r/min离心5 min。将上层液相移入一新管，加入0.5 mL 异丙醇后混匀，室温作用10 min后，于4 ℃ 下以12 000 r/min离心10 min。弃上清，以体积分数0.75乙醇1 mL洗涤沉淀，4 ℃ 下以7 500 r/min离心5 min。吸去上清，超净台中吹干（5～10 min）后溶于20～50 μL 无RNA 酶水中，测定RNA 浓度。将500 ng Oligo （dT） 15-18mer与1～5 μg 总RNA混匀后， 加入无RNA酶水中至总体积为11 μL。用PCR 仪以热盖加热的方式70 ℃ 作用10 min。稍微离心后迅速移至冰上，并加入4 μL 5× First strand buffer、2 μL dNTP 混合液（10 mmol/L）和2 μL DTT （100 mmol/L）。吹打混匀以后，加入1 μL PowerScript RT 并吹匀。42 ℃ 作用50～90 min。70 ℃ 作用15 min 终止反应。
1.2.5 实时定量RT-PCR
查询TN-C cDNA 序列，参照网络引物设计软件Primer 3程序（http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cgi-bin /primer/primer3.cgi）设计引物。引物序列为：β-actin sense，5′-AGAAGGATTCCTATGTGGGCG-3′，antisense5′-CATGTCGTCCCAGTTGGTGAC-3′；TN-C for-ward primer， 5′-CAGCTCCACACTCCAGGTAC-3′，antisense 5′-CTTTCGCTGG-GCTCTGAAGG-3′。加入荧光染料SYBR Green，利用常规PCR 方法进行目标片段扩增。以合成cDNA 为模板进行PCR 反应。反应体系包括：模板2 μL，引物各0.5 μg，Pfu 酶 1.25 U，dNTPs 2 μL，10×buffer5 μL，加水至50 μL。扩增条件：94 ℃变性5 min；然后94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 延伸3 min，循环30次；72 ℃延伸5 min。利用Ct方法（Ct为PCR循环产物和初始荧光强度之比）计算相对含量，最后与内参照-actin比对校正。 1.2.6 蛋白激酶抑制实验
在即将进行周期机械力和细胞因子培养细胞前60 min，分别加入不同蛋白激酶阻断剂。细胞进行后继处理作用一段时间后收集细胞裂解，以实时定量RT-PCR判断TN-C转录。
2 结果
2.1 等双轴周期性压力装置
利用我们专利的VAD作为动力来源提供周期性牵张力。其外观和内部构造如图1A和图1B所示。图1C所示为受外力作用而产生周期性牵张力的细胞培养系统模式图：VAD推动可上下移动模块将压力向上传递至培养板底部，六孔细胞培养板为特制没有底板的，将受外力后可延展的硅酮膜（图1C上部分白色圆圈部位）置于支架和六孔培养板之间，作为细胞培养板的底板，将培养板固定于支架。
2.2 参与压力诱生TN-C的信号传导途径
在体外培养系统中，机械力都能刺激TN-C在风心病瓣膜和畸形瓣膜中的转录，但是风心病瓣膜显得丰度更高（图2）。蛋白激酶抑制实验结果显示，机械力利用RhoA/ROCK途径诱导TN-C的转录，而不是ERK 1/2、 p38MAPK或者PKC途径（图3）。
3 讨 论
机械力作为生物体内正常存在的作用因素，在生理和病理情况下都发挥着重要的作用，而对应的如何在体外模仿机械力，尤其是具有方向性和一定频率的机械力，被很多实验室从生物力学和生物工程学方面发展并加以利用。本课题所用的提供机械力来源的装置是我们的专利产品，是为了制造一种体外心室辅助装置而用于临床。因为其可以产生稳定的机械压力而被用于本课题当中。
细胞通过其表面的黏附因子如Integrin成员和ECM组分而结合，进而感受机械力，用来模拟ECM的纤连蛋白和胶原蛋白，文献显示，不同的蛋白最终处理情况是有所不同的，如纤连蛋白自然干燥就可以，而胶原蛋白则需要用紫外线照射［5］。假如不包被ECM，一方面细胞无法牢固地黏附于硅酮膜，另一方面则无法通过细胞骨架传递外源的机械张力。
本研究所用的硅酮膜是一种同向延展性非常好的载体。所谓的等双轴周期性压力指当从下方传来的机械力作用时，在膜上贴附的细胞在各个方向所受到的牵张力是一致的，这样就保证了实验系统的稳定性和可对照性。
参考文献
［5］所述以及我们的分析，将所用参数定为10%、3 Hz。本文结果显示，瓣膜畸形和风湿性瓣膜病病人的瓣膜间质细胞对于机械力反应有所不同，我们认为是由于表面分布的黏附因子或者下游的活化信号少而造成的。总而言之，本研究确立了良好的细胞体外机械力培养体系，为我们下一步的工作打下良好的基础。
【参考文献】
1］段翔鹰，李莉. 风湿性心脏病并发心房颤动的临床因素比较［J］. 齐鲁医学杂志， 2007，22：429-430.
［2］DOGAN S， AYDIN M， GURSURER M， et al. Prediction of subclinical left ventricular dysfunction with strain rate imaging in patients with mild to moderate rheumatic mitral stenosis［J］. J Am Soc Echocardiogr， 2006，19:243.
［3］FLUCK M， TUNC-CIVELEK V， CHIQUET M. Rapid and reciprocal regulation of tenascin-C and tenascin-Y expression by loading of skeletal muscle［J］. J Cell Sci， 2000，113: 3583.
［4］DURLU-KANDILCI N T， BRADING A F. Involvement of Rho kinase and protein kinase C in carbachol-induced calcium sensitization in beta-escin skinned rat and guinea-pig bladders［J］. Br J Pharmacol， 2006，148:376.
［5］CHIQUET M， SARASA-RENEDO A， TUNC-CIVELEK V. Induction of tenascin-C by cyclic tensile strain versus growth factors: distinct contributions by Rho/ROCK and MAPK signaling pathways［J］. Biochim Biophys Acta， 2004，1693:193.