关于重组内皮抑素对碱烧伤诱导角膜新生血管抑制作用

【摘要】 目的 探讨重组内皮抑素对碱烧伤诱导兔角膜新生血管（CNV）的抑制作用。方法新西兰大白兔20 只，随机分为两组，每组10只。采用碱烧伤法制备兔CNV 模型后，实验组球结膜下注射重组人内皮抑素0.05 mL，对照组球结膜下注射生理盐水0.05 mL，均隔日1 次，共注射19 d。每日裂隙灯显微镜下观察并测量自角膜缘长出的CNV长度和数量，并摄影，输入计算机经图像分析系统计算CNV面积。术后19 d处死动物，取角膜， CD34染色，显微镜下检测微血管密度（MVD）。结果实验组第7、14、19天CNV面积及MVD明显少于对照组，差异有显著性(t=4.191～8.003，P&<0.01)。结论 重组内皮抑素可有效抑制CNV生长，为临床防治CNV 提供了一种新的方法。
【关键词】 内皮抑素类；角膜新生血管化；烧伤，化学；兔
［ABSTRACT］ Objective To explore the inhibitory action of recombinant endostatin on corneal neovascularization (CNV) in rabbit caused by alkali burn. Methods Twenty New Zealand white rabbits were equally pided into two groups. Alkali burn was used to prepare a neovascularization model and recombinant human endostatin (0.05 mL) was injected into subconjunctival tissue of the rabbits in experiment group and normal saline (0.05 mL) was injected into same tissue in control group， once every other day for 19 days. Slitlamp microscopic observation was done daily， the number and the length of CNV erupted from limbus of cornea were determined and photographed， which were transmitted to computer and the area of CNV was calculated through imageanalysis. The animals were killed 19 days after the procedure， the cornea collected and CD34 stain done. The microvessel quantity (MVD) was counted microscopically. Results The experiment group showed smaller CNV area on day 7， 14， and 19 and lower MVD than the control， the difference was significant (t=4.191-8.003，P&<0.01). Conclusion Recombinant endostain can effectively inhibit the growth of CNV， which provides a new method for the prevention and treatment of this condition.
　　［KEY WORDS］ Endostatin; Corneal neovascularization; Burn， chemical; Rabbits
　　内皮抑素是1997年由O’RELLY[1]等分离纯化获得的一种血管内皮细胞的强效抑制剂，能特异性抑制已经被激活的血管内皮细胞的增殖，阻断新生血管的生成。本文观察内皮抑素抑制兔眼角膜新生血管（CNV）形成的效果，为其用于治疗眼部新生血管性疾病及肿瘤奠定基础，现报告如下。
　　1　　 材料与方法
　　1.1　　 实验材料
　　实验动物为健康新西兰大白兔20只，雄兔11只，雌兔9只，体质量2.0～2. 5 kg，眼裂隙灯显微镜检查无眼病，青岛大学医学院实验动物中心提供。重组内皮抑素由我院中心实验室克隆和表达[2]，纯度92%， 用生理盐水稀释制成50 mg／L的溶液。所用仪器有：裂隙灯显微镜，数码照相机，计算机图像分析系统，眼科显微手术器材，CD34及免疫组化检测试剂盒（购自北京中山生物技术有限公司）。
　　1.2　　 实验方法
　　将20只大白兔随机分为实验组和对照组，每组10只(双眼)，均用苯巴比妥（30 mg／kg）自耳缘静脉注射行全麻，5 g/L丁卡因术前点眼行角膜局麻，在无菌条件下，用统一规格（直径3.0 mm）单层圆形滤纸浸入1 mol/L氢氧化钠溶液1 min， 达到饱和状态后取出，甩干多余液体，贴敷于角膜中央50 s，取下，立即用50 mL生理盐水冲洗角膜及结膜囊，回笼后正常饲养。角膜碱烧伤后第1天起，实验组球结膜下注射重组人内皮抑素0.05 mL，对照组球结膜下注射生理盐水0.05 mL，均隔日1次，共19 d。
　　每天滴氯霉素滴眼液（润舒）6 次，夜晚涂红霉素眼膏1次。
　　1.3　　 CNV检测
　　每日裂隙灯显微镜下（放大8倍）观察，测量自角膜缘长出的CNV长度和数量，并摄影，输入计算机经图像分析系统计算CNV 面积（A）[3]。
　　1.4　　 微血管密度（MVD）检测
　　碱烧伤后第19天，各组兔子均用空气栓塞法处死，取角膜，石蜡包埋、切片，行苏木精伊红染色及CD34免疫组化染色。CD34染色以血管内皮细胞胞浆及胞膜出现棕黄色颗粒为阳性判断标准。在低倍镜下（100倍）选取角膜血管内皮细胞染色清晰，背景对照良好的5个视野，然后在高倍镜下（400倍）计数所有染色的微血管数，取其平均值作为该切片的MVD。
　　1.5　　 统计学处理
　　采用SPSS 13.0统计分析软件进行数据处理， 结果以±s表示，数据间比较采用t检验。
　　2　　 结果
　　2.1　　 两组CNV比较
　　碱烧伤后最初3 d，两组结膜均表现为混合充血，烧伤区角膜呈灰白色水肿，第4天两组CNV开始长入角膜缘内， 实验组与对照组CNV 生长情况无明显差异。术后7～14 d，对照组CNV生长最为旺盛，血管粗密， 面积为(8.48±1.03)～ (23.91±1.82) mm2；实验组CNV细小、稀疏、生长缓慢，面积为(5.67±0.61)～ (17.71±1.65)mm2。两组术后7～14 d CNV生长面积比较，差异有显著性(t=7.443、8.003，P&<0.01)。见表1。术后15～16 d两组血管生长减慢，开始消退，但19 d两组CNV面积比较，差异仍有显著性（t=6.639，P&<0.01）。 表1　　 两组兔角膜碱烧伤后不同时间CNV面积比较
　　2.2　　 两组MVD比较
　　苏木精伊红染色显示，对照组角膜全基质内可见大量新生血管，管壁薄，管腔大，排列紊乱；实验组浅基质层内可见较少量新生毛细血管，且管腔较小，分布较稀疏。免疫组化染色示，CD34在血管内皮细胞胞浆及胞膜表达，对照组血管多，管腔大，黄染区多，MVD为5.87±1.44；实验组CNV 稀少，管腔细，黄染区少，MVD为3.60±0.94。两组MVD比较，差异有显著性（t= 4.191，P&<0.05）。
　　3　　 讨　　　　 论
　　内皮抑素是近几年发现的血管生成抑制剂。DHANABAL等[4]研究显示，内皮抑素能特异性抑制处于增殖状态的新生血管内皮细胞，并伴有诱导凋亡的作用。近年来，国内外学者对内皮抑素的研究主要集中在其对肿瘤的治疗作用。动物实验显示，内皮抑素能够阻断肿瘤细胞的血液供应， 使肿瘤消退[5，6]，用于肿瘤治疗取得了良好的效果。
　　各种病因，如配戴角膜接触镜、角膜创伤、手术、感染等导致的CNV增生是致盲的重要原因之一， 亦是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素， 但在临床上对于CNV的治疗至今还是一个极为棘手的问题。CNV是由角膜缘血管网形成的新生毛细血管逐渐侵入角膜而形成，与血管内皮细胞的增殖密切相关，因此，对CNV抑制性药物进行研究，对于CNV的防治、保持角膜透明性、恢复视力有着重要意义。CNV性疾病将是应用内皮抑素进行治疗的一个良好适应证。

　　本文实验采用碱烧伤法诱导CNV的形成[7]，该模型非常逼真地再现了角膜碱烧伤的病理状态，是研究炎症性新生血管发生机制和治疗的重要手段，且此模型操作简便，便于观察和比较新生血管生长状况。我们将重组内皮抑素用于治疗碱烧伤法诱导的角膜CNV，观察其抑制CNV的效果。结果显示，重组内皮抑素可明显抑制CNV的增生。
　　本文观察了不同时间CNV生长情况，发现碱烧伤后7～14 d为血管生长最旺盛时期。内皮抑素能够明显抑制CNV的增生，主要表现为CNV生长速度减慢，生长面积较小。本文实验组CNV面积明显低于对照组，MVD也明显低于对照组， 差异有统计学意义。
　　目前，有关内皮抑素抑制新生血管形成的机制还不很清楚。RAPRAEGER等[8]研究表明，内皮抑素可通过与内皮细胞表面硫酸肝素糖蛋白结合，抑制促血管生成因子VEGF 和FGF2与内皮细胞的结合，从而干扰细胞黏附、迁移。此外，有关内皮抑素抑制内皮细胞的迁移机制包括：①内皮抑素与原肌球蛋白结合破坏微丝结构的完整性，从而导致细胞运动功能丧失[9]; ②与抑制基质外金属蛋白酶有关，基质外金属蛋白酶是一种含锌结构的内源性多肽，在新生血管的形成中起重要作用，它可以选择性地降解细胞外基质，这是新生血管生成开始阶段细胞侵入和迁移所必需的，内皮抑素与基质外金属蛋白酶酶原结合抑制该酶的激活[10]。
　　本文实验结果显示，内皮抑素并不能完全抑制CNV的增长，说明CNV的发生是一个复杂的、由多种因子共同调节的过程， 单一因子可能并不能完全抑制其生长。实验过程中实验组与对照组结膜充血程度、角膜反应相似，角膜水肿的消退过程基本一致，证明内皮抑素在眼部应用是安全的，不影响碱烧伤后角膜的愈合过程。
　　综上所述， 内皮抑素可以在一定程度上起到抑制角膜CNV的作用， 但目前关于其在眼部的药物动力学和生物利用度方面的研究还缺乏。如能进一步加强这方面的研究及提高纯化技术，并将其制造成为利于眼部使用的剂型，将为CNV的治疗提供新的途径。
【参考文献】
[1]O’REILLY M S， BOEHM T， FOLKMAN J， et al. Endostatin: an endogenous inhibitorof angiogenesis and tumor growth[J]. Cell， 1997，88(2):277285.

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[3]DAMATO R J， LOUSHNAIL M S. FLYPN E， et al. Thalldomide is aninhibitor of an giogenesis[J]. Proc Ncad Sci USA， 1994，91:40824085.

[4]DHANABAL M， RAMCHANERAN R， WATERMAN M J， et al. Endostatin induces endothelial cell apoptosis[J]. J Biol Chem， 1999，247(17):11721.

[5]倪庆桂，汪振诚，徐根兴，等. 人内皮抑素的基因克隆及其表达产物的抗肿瘤活性[J]. 南京军区医院学报， 2002，24(1)：1.

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[7]邱培瑾. 角膜新生血管的动物模型[J]. 国外医学：眼科学分册， 2000， 24: 360363.

[8]RAPRAEGER A C， KRUFKA A， OLWIN B B. Requirement of heparan sulfate for bFGF 2 mediated fibroblast growth and myoblas differention[J]. Science， 1991，252:17051708.

[9]ERGER A C， FELDMAN A L. The angiogenesis inhibitor， endostatin， does not affect murine cutaneous wound healin[J]. J Sur Res， 2000，91(1):2631.

[10]欣坚. 内皮抑素的研究进展[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志， 2003，10(1):6567.