关于2型糖尿病大鼠Ghrelin表达及与胃排空关系

　　　　　　 作者：张兆然 魏良洲 杨林 孔心涓 田字彬

【摘要】 目的 探讨2型糖尿病大鼠血清及胃组织Ghrelin表达变化与胃排空的关系。方法 将大鼠随机分为糖尿病组、单纯肥胖组和对照组，通过高糖高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素（STZ）的方法建立2型糖尿病大鼠动物模型。饲养8周后糖尿病组注射STZ后，检测并计算各组大鼠体质量、空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数、胃排空、血清Ghrelin及胃组织Ghrelin mRNA表达。结果 糖尿病组和单纯肥胖组大鼠饲养8周后，体质量和胰岛素水平较对照组明显升高（F=63.90、16.72，q=12.76～14.51，P&<0.01），血糖与对照组比较差异无显著性（P&>0.05）。注射STZ后，糖尿病组大鼠血糖水平升高，与对照组比较差异有显著性（F=129.00，q=20.50，P&<0.05），而胰岛素水平与对照组差异无显著性（P&>0.05）。糖尿病组和单纯肥胖组大鼠液体胃排空低于对照组（F=123.00，q=19.49、18.52，P&<0.05），血清Ghrelin、胃组织Ghrelin mRNA表达均明显下降(F=35.01、34.69，q=8.73～11.16，P&<0.05)。结论 2型糖尿病大鼠血清Ghrelin水平、胃组织Ghrelin mRNA表达的下降可能与糖尿病胃排空障碍有关。
【关键词】 糖尿病，2型；胃排空；Ghrelin
［ABSTRACT］ Objective To investigate the association of Ghrelin expression with gastric emptying in type 2 diabetic rats. Methods Rats were randomly pided into three groups: diabetes， simple obesity and normal control. A type2diabetes rat model was set up by feeding highglucose and highfat diet combined with lowdose STZ peritoneal injection. At the end of eight weeks and after STZ injection， the body mass， blood glucose， gastric emptying， Ghrelin and Ghrelin mRNA were detected. Results Compared with the controls， body mass and insulin were increased significantly (F=63.90，16.72;q=12.76-14.51;P&<0.01) in diabetes and simple obesity groups， and blood glucose was increased， but did not reach statistical significance (P&>0.05)， after injection of STZ， blood glucose increased significantly (F=129.00，q=20.50，P&<0.05)， but the difference of insulin levels was not significant (P&>0.05). Gastric emptying， expressions of Ghrelin in serum and Ghrelin mRNA in gastric tissue in diabetis and simple obesity groups were lower than that of the control (F=34.69-123.00，q=8.73-19.49，P&<0.05). Conclusion Decrease of serum Ghrelin and low gastric Ghrelin mRNA expression in the rat with type 2 diabetes are probably related to disorder of gastric emptying.
　　［KEY WORDS］ Diabetes mellitus， type 2; Gastric emptying; Ghrelin
　　糖尿病胃轻瘫是糖尿病常见的并发症，其发病率高达30%～50%。其典型临床表现为恶心、呕吐、早饱、腹胀、腹痛、食欲不振等症状，产生上述症状主要和胃动力障碍有关。研究发现，Ghrelin具有调节能量平衡和促进胃肠运动等多种生物学作用。本研究以2型糖尿病大鼠模型为研究对象，观察Ghrelin在2型糖尿病大鼠血清和胃组织中的表达情况及其与胃排空延迟的关系。
　　1　　 材料和方法
　　1.1　　 大鼠糖尿病模型的建立和分组
　　SPF级雄性Wistar大鼠30只（购自青岛市动物实验中心），8周龄，体质量约180 g，适应性喂养1周后随机分成糖尿病组、单纯肥胖组和对照组，每组10只。糖尿病组和单纯肥胖组大鼠喂以高糖高脂饲料（猪油10%，蔗糖20%，胆固醇2.5%，胆酸钠1%，常规饲料66.5%），饮用120 g/L果糖水[1]。对照组喂以常规饲料，饮用自来水。大鼠在高糖高脂饮食8周后，测定体质量、血糖及胰岛素水平，单纯肥胖组出现体质量增加及胰岛素抵抗者为模型成功（10只）。糖尿病组禁食不禁水12 h，腹腔一次性注射30 mg/kg STZ（Sigma公司），单纯肥胖组及对照组腹腔注入同等体积的枸橼酸缓冲液，注射48 h后测定血糖及胰岛素水平，血糖≥16.7 mmol/ L 并伴有胰岛素抵抗者为2型糖尿病模型成功（8只）。在整个造模及分组的过程中，大鼠每周及处死当天测定空腹血糖，同时测量体质量，观察大鼠一般情况。
　　1.2　　 胃排空的测定
　　造模成功后，在大鼠禁食不禁水16 h后，给予1.5 mmol/L的酚红溶液2 mL灌胃，15 min后处死大鼠，剖腹，结扎贲门和幽门，取出整个鼠胃，沿胃大弯切开，以蒸馏水冲洗胃内容物，定容为20 mL，然后加入0.5 mol/L NaOH 20 mL搅拌混匀，静置1 h，取5 mL上清液加入200 g/L三氯乙酸0.5 mL去蛋白，以3 500 r/min(离心半径10 cm)离心10 min， 取上清液用分光光度计在560 nm 波长处测定吸光度值。另取酚红溶液2 mL，先后加入蒸馏水18 mL、0.5 mol/L NaOH 20 mL、200 g/L三氯乙酸4 mL搅拌混匀，测定吸光度值。大鼠胃排空率=(1-实测酚红吸光度/标准酚红吸光度)×100%[2]。　
　　1.3　　 血清Ghrelin的测定
　　根据Ghrelin酶联免疫试剂盒说明，利用生物素标记肽与样本中待测肽类竞争性结合抗体的原理，检测450 nm波长处吸光度，并计算出结果。
　　1.4　　 荧光RTPCR检测胃组织Ghrelin表达
　　用Trizol试剂提取胃组织总RNA，以10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，并进行核酸的纯度和浓度分析，逆转录合成cDNA，根据GenBank中的相应序列设计合成目的片段和内参照引物。以GAPDH为内参照物，其上游引物为5′TTCTAGAGACAGCCGCATCT3′，下游引物为5′TGGTAACCAGGTGTCCGATA3′，产物长度为106 bp；Ghrelin目的片段上游引物为5′CAGAGCACCAGAAAGCCCAGCAG3′，下游引物为5′CCAACATCGAAGGGAGCATTGAA3′，产物长度为160 bp。根据SYBRGreen染料法（Takara试剂盒，大连宝生物有限公司）进行荧光定量PCR。反应结束后，取扩增产物4 μL，用16 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线灯下观察结果，电泳图见特异性条带。
　　分析DNA扩增曲线，利用专用数据处理软件得出数据并进行误差分析。采用2-△△ct法进行定量分析。ct值为荧光信号显著增长时的循环次数，△ct=样品的ct均值-内参照的ct均值，△△ct=△ct-（随机对照组样品的ct均值-内参照的ct均值），然后取2-△△ct即代表某样品其初始cDNA的相对量[3]。
　　1.5　　 统计学分析
　　所有计量资料均以±s表示，用SPSS 11.5及PPMS 1.5[4]统计软件进行单因素方差分析和两两比较q检验。
　　2　　 结果
　　2.1　　 一般情况
　　8周末对照组大鼠毛发光泽，体态匀称；单纯肥胖组大鼠安静，不喜动，饮食量及饮水量明显增加，解剖发现皮下、腹内脂肪堆积，腹内肠胀气，体型粗短，呈向心性肥胖；糖尿病组大鼠STZ注射48 h后出现精神萎靡。高糖高脂饮食8周后，糖尿病组和单纯肥胖组大鼠体质量较对照组均显著增加(F=63.90，q=12.76～14.51，P&<0.05)；糖尿病组和单纯肥胖组之间差异无显著性（P&>0.05）。见表1。
　　2.2　　 血糖、胰岛素水平及胰岛素抵抗指数
　　高糖高脂饮食8周后，单纯肥胖组和糖尿病组胰岛素水平较对照组均显著升高（F=16.72，q=7.32、6.67，P&<0.05）；胰岛素抵抗指数（空腹血糖与空腹胰岛素乘积除以22.5）较对照组均显著增高(F=46.87，q=13.63、5.33，P&<0.05)；血糖有所增高，但与对照组比较差异无显著性（F=0.54，P&>0.05）。糖尿病组和单纯肥胖组血糖、胰岛素水平差异均无显著性（P&>0.05）。见表1。
　　注射STZ或枸橼酸缓冲液后，糖尿病组大鼠胰岛素水平下降，与单纯肥胖组比较差异有显著意义（F=22.73， q=7.14，P&<0.05），与对照组比较差异无显著性（q=1.28，P&>0.05）;血糖水平升高达到糖尿病诊断标准，与对照组及单纯肥胖组比较差异有显著意义（F=129.00，q=20.50、19.58，P&<0.05）。单纯肥胖组与对照组比较血糖水平差异无显著性（q=0.99，P&>0.05），胰岛素水平差异有显著性（q=8.94，P&<0.05）。见表1。

　　2.3　　 胃排空、血清Ghrelin水平及胃组织Ghrelin mRNA表达
　　8周末单纯肥胖组大鼠的液体胃排空率低于对照组（F=123.00， q=19.49，P&<0.05），血清Ghrelin及胃组织Ghrelin mRNA表达较对照组明显下降(F=35.01、34.69， q=11.16、10.02，P&<0.05)。 注射STZ后糖尿病组大鼠的液体胃排空率低于对照组（q=18.52，P&<0.05），血清Ghrelin水平及胃组织Ghrelin mRNA表达较对照组均明显下降(q=8.73、 10.18，P&<0.05)。见表2。标本荧光定量扩 表1 注射STZ前后各组大鼠体质量、血糖及血清胰岛素水平表2 各组大鼠胃排空、血清Ghrelin水平以及胃组织Ghrelin mRNA表达的比较
　　3　　 讨 论
　　本实验通过高糖高脂饮食诱导高胰岛素血症和胰岛素抵抗，制备单纯肥胖大鼠，再通过注射亚致病剂量STZ破坏胰腺功能，导致胰腺代偿性分泌胰岛素的功能障碍，最后诱导出高糖血症。目前多采用此方法制备2型糖尿病模型[1]。
　　Ghrelin是近年来发现的一种由28个氨基酸残基组成的脑肠肽激素，主要由胃底部黏膜泌酸腺X/A细胞合成并分泌入血，其氨基酸序列与胃动素相似，且受体之间也有50%的同源性，Ghrelin第3位的丝氨酸辛酰化是主要活性形式，可以自由通过血脑脊液屏障，通过与其受体结合发挥出和胃动素类似的加速胃排空的作用，因此Ghrelin也称胃动素相关肽[5]。MASUDA等［6］研究显示，大鼠静脉注射Ghrelin 10 min后胃运动幅度达到最大，胃排空加快。而人体试验表明，静脉给予Ghrelin可明显加快自发性胃轻瘫及糖尿病胃轻瘫病人的胃排空，使腹胀等症状得到改善［7］。
　　由于Ghrelin的受体即生长激素促分泌素受体（GHSR)不仅分布在中枢，而且在大部分外周组织中也有分布。原位杂交研究显示，GHSR主要存在于下丘脑弓状核[8]，在人和大鼠胃、结肠组织神经元胞体和纤维、胃腺相关细胞、公认的肠内分泌细胞和（或）肥大细胞中及大鼠肌肉相关神经纤维上也有GHSR免疫反应性，同时有研究表明，GHSR存在于迷走传入神经元和肠壁及肠肌丛神经元上。
　　本实验对3组大鼠血糖、胰岛素、胃排空、血清Ghrelin及胃组织Ghrelin mRNA进行了测定，结果显示，糖尿病组和单纯肥胖组大鼠胃排空、血清Ghrelin和胃组织Ghrelin mRNA与对照组相比有明显下降。国内相关研究显示，1型糖尿病大鼠胃排空延迟，胃黏膜腺体内Ghrelin含量明显减少，腺体染色呈空泡状，但Ghrelin mRNA的表达却有代偿性增加，提示1型糖尿病大鼠Ghrelin与胃排空没有关系，其主要作用为增加摄食、维持能量平衡[9]。本研究显示，2型糖尿病和单纯肥胖组大鼠胃排空、胃组织Ghrelin的含量、血清Ghrelin浓度均明显下降。本文结果提示，2型糖尿病与1型糖尿病大鼠之间在Ghrelin及其mRNA表达上是存在不同的，血清中即循环中的Ghrelin含量都是下降的，但是在胃组织中2型糖尿病依然是下降的。Ghrelin主要是通过与其中枢的受体结合而发挥促胃动力，加快胃排空的作用，而循环及组织中Ghrelin含量的下降，必然会导致通过血脑脊液屏障并与受体结合的Ghrelin量的下降，从而影响Ghrelin促胃动力作用的发挥。推断在2型糖尿病及有胰岛素抵抗大鼠中，血清Ghrelin和胃组织中Ghrelin mRNA表达的下降有可能参与了糖尿病胃排空的延迟。
　　2型糖尿病及胰岛素抵抗时Ghrelin在循环及组织水平的下降，对机体的多种生理调节产生了严重影响[10]。就目前研究结果来看，糖尿病胃排空障碍产生的原因不是单一的，对Ghrelin的深入研究有助于更好地探讨糖尿病胃排空延迟的机制。
【

参考文献

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