【摘要】 目的 研究青岛地区家族性及早发性乳癌病人乳癌易感基因-1（BRCA-1）外显子2、20的突变情况，探讨其与乳癌发病的关系。方法 选取青岛地区家族性乳癌病人（家系中至少一个一级亲属有乳癌患病史）30例、早发性乳癌（发病年龄＜35岁）25例为实验组，以20例乳腺良性肿瘤病人为对照组。应用PCR技术和DNA直接测序技术检测所有标本BRCA1基因外显子2、20的突变情况。结果 实验组与对照组在外显子2和20的序列中均未发现有突变。结论 BRCA1基因外显子2和20上的序列突变对青岛地区家族性及早发性乳癌发生的影响不大，有待于寻找BRCA1基因的其他突变热点。
【关键词】 乳腺肿瘤；BRCA1基因；基因突变;青岛
［ABSTRACT］ Objective［ To investigate the mutation sites of BRCA1 gene exon2 and exon20 in familial and early-onset breast cancer in Qingdao and study their association with the development of the condition.［ Methods［ Thirty patients with familial breast cancer in Qingdao area were recruited in this study， of whom， at least one of the first-degree relative had a history of breast cancer. Those with early-life cancer （age of onset&<35 years） were served as experimental group， and 20 with benign breast tumors as controls. Exons （2， 20） of BRCA1 gene were analyzed by polymerase chain reaction （PCR） and DNA sequencing.［ Results［ No mutations were found in exons 2 and 20 in all cases. ［ Conclusion［ The gene sequence mutations do not much contribute familial and early-onset breast cancer in this area. The hot spot of other mutations of BRCA1 gene is to be looking for.
［KEY WORDS］Breast tumour; BRCA1 gene; Mutation; Qingdao
乳癌是女性常见的恶性肿瘤之一，可分为散发性和遗传性两类，其中遗传性乳癌约占乳癌发病率的5%～10%。乳癌易感基因-1（BRCA-1） 是近年来发现的一种重要的肿瘤抑制基因。近年来研究表明，BRCA1基因结构和功能的异常与45%的家族性乳癌、卵巢癌的发生有关［1］，BRCA1在人类乳癌形成和细胞分化中起重要作用［2］。其基因突变可以常染色体显性遗传方式传递给子代。对BRCA1 基因进行检测，寻找其致病突变位点，可帮助筛选出高危人群，有助于风险评估和早期诊断；同时也可为未来的高危人群基因筛查和基因诊断提供基本突变谱资料。BRCA1基因在世界各地乳癌病人中的突变有差异。本研究应用PCR及DNA直接测序方法，分析了30例家族性乳癌及25例早发性乳癌病人BRCA1基因第2、20外显子序列，探讨家族性及早发性乳癌BRCA1基因的突变情况。现报告如下。
1 对象与方法
1.1 对象
收集青岛大学医学院附属医院病理科2005～2007年的经病理确诊的乳癌石蜡包埋标本55例，其中家族性乳癌（家系中至少一个一级亲属有乳癌患病史）病人30例，年龄小于35岁乳癌病人25例。同时，取乳腺良性肿瘤病人20例作为对照组，均抽取2 mL静脉血，EDTA抗凝，置-20 ℃冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取
将乳癌石蜡标本切取层厚为5 μm的切片5～6层并置于1.5 mL EP管中，应用碧云天生物技术研究所出品的基因组DNA小量提取试剂盒（D0063）从石蜡标本中提取基因组DNA。对照组取血后当天从全血中提取淋巴细胞，将细胞裂解，按常规酚-氯仿法提取DNA，溶于TE液中，-20 ℃保存备用。DNA的纯度及含量经紫外线分光光度仪（Beckman DU640） 测定。
1.2.2 引物设计
根据文献［3，4］，在BRCA1存在突变热点的区域选择设计两对引物Exon2和Exon20（均由大连宝生物工程公司合成）。其中第一对引物用于特异性扩增BRCA1基因序列（GenBank L78833）第4557～4814位上的258个碱基，引物序列如下：上游引物5′-GAAGTTGTCATTTTAT-AAACCTTT-3′，下游引物5′-TGTCTTTTCTTCCCTAGTATGT-3′。第二对引物用于特异性扩增BRCA1基因序列第71518～71918位上的401个碱基，引物序列如下：上游引物5′-ATATGACGTG-TCTGCTCCAC-3′，下游引物5′-GGGAATCCAAA-TTACACAGC-3′。
1.2.3 PCR扩增
PCR反应体系及条件：总反应体系50 μL，内含DNA模板1 μg（根据DNA模板浓度添加），2×PCR TaqMix 25 μL，上下游引物（浓度均为10 μmol/L）2 μL，超纯水补足反应体积至50 μL。PCR反应参数：95 ℃预变性2 min； 94℃变性2 min， 50 ℃退火1 min， 72 ℃延伸36 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。
1.2.4 PCR产物鉴定
取5 μL PCR扩增产物并加入1 μL Loading buffer，经20 g/L含有EB的琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余的置-20 ℃保存备用。
1.2.5 PCR产物直接测序
将PCR扩增产物各40 μL送上海生工生物工程技术有限公司进行双向测序。将所得序列测定结果同GenBank中 cDNA BRCA1（U14680）正常的基因序列进行对照，判断有无基因突变，然后再将所检测到的BRCA1突变位点与乳癌信息中心网站数据库（BIC）对照，判断是否为致病性突变位点。
2 结果
2.1 PCR扩增
本文55例乳癌病人及20例乳腺良性肿瘤病人BRCA1基因第2和20外显子的PCR扩增产物，其在20 g/L琼脂糖凝胶中电泳检测均显示单一条带，与对照组的相应片段长度一致，结果表明，75例病人BRCA1基因在所检测的片段上没有明显的插入或缺失（图1、2）。
2.2 DNA测序
本文75例病人PCR扩增产物经DNA直接测序，并将序列测定结果与GenBank中cDNA BRCA1（U14680）正常的基因序列进行对照，在外显子2和20的序列中均未发现有突变。
3 讨论
1990年，HALL等［5］用连锁分析的方法发现早发性家族遗传性乳癌的发生与染色体17q21的一个基因突变有关，并将其命名为BRCA1。1994年，MIKI成功地克隆此基因，从此对BRCA1的功能、突变情况及其与乳癌、卵巢癌发生关系的研究迅速深入开展起来。BRCA1定位于染色体17q21，约占染色体组DNA的10万个碱基范围，包括22个外显子，其中最大的外显子11长度约为3.4 kb，表达7.8 kb的mRNA和1 836个氨基酸的蛋白质，相对分子质量为20万。BRCA1蛋白的氨基酸末端含有一个在许多核酸结合蛋白中发现的锌指结构，这提示BRCA1可调节基因表达。大量的实验结果表明BRCA1为一种抑癌基因， 其编码抑癌蛋白，具有DNA损伤修复、转录活化与抑制、细胞周期的调节作用、中心体复制的负性调节作用等，对肿瘤生长起负性调节作用，其突变和低表达是诱发乳癌的主要原因之一。
ANNIKA等［7］对瑞典24例家族性乳癌-卵巢癌病人进行研究，结果显示，BRCA1的突变率为75%，其早发性乳癌（≤40岁）BRCA1的突变率为23%。CORSKI等［8］检测波兰35例家族性乳癌病人BRCA1的突变率为34.3%。而1995年INOUE等［9］对日本18个乳癌家族及2个卵巢癌家族的研究显示，仅检测到2例乳癌存在突变。新加坡学者在76例中国妇女乳癌病人中检测到6例突变，突变率为8.6%［10］。在中国有关BRCA1基因突变的报道例数不多，赖春宁等［11］检测186例散发性乳癌BRCA1的突变率为7%。均低于欧美国家。原因可能为肿瘤相关基因在不同环境、不同种族中作用程度各不相同［12］，也说明在BRCA1之外还存在其他乳癌相关基因，故尚需扩大样本和检测范围来进一步研究。
目前对BRCA1检测方法除了DNA直接测序技术，还有单链构象多态性（SSCP） 分析法以及蛋白截断实验（PTT），工作量都较大，也不能检测到所有的突变，因此给临床应用带来不便。但对高危人群进行BRCA1突变检测，以早期发现突变携带者，及时采取一些预防措施有一定意义。BRCA1的进一步研究对阐明乳癌发病机制和临床上乳癌的防治都有重要意义。
【参考文献】
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