肾上腺髓质素缺失对单侧输尿管结扎小鼠MMP1/TIMP1表达的影响

　　　　作者：王香婷 许庆友 丁英钧　王月华 王筝 谷艳丽 张磊磊

【摘要】 目的 探讨肾上腺髓质素在肾间质纤维化实验动物肾脏基质金属蛋白酶1/基质金属蛋白酶抑制剂1(MMP1/TIMP1)表达中的作用。方法 结扎肾上腺髓质素基因敲除小鼠及野生小鼠单侧输尿管，制备肾间质纤维化实验动物模型并给予缬沙坦灌胃治疗，采用免疫组化、原位杂交、RTPCR方法检测MMP1及TIMP1的表达。结果 单侧输尿管结扎 (UUO) 小鼠肾脏MMP1的表达减弱，而TIMP1的表达显著上调，基因敲除小鼠较野生小鼠更为明显，采用缬沙坦治疗可部分抑制TIMP1的表达。结论 肾上腺髓质素可以通过纠正MMP1/TIMP1的失衡，对UUO介导的肾间质纤维化起到保护作用。

【关键词】 肾上腺髓质素；单侧输尿管结扎；基质金属蛋白酶1；基质金属蛋白酶抑制剂1

　　肾上腺髓质素是新发现的一种内源性血管活性肽，广泛存在于机体的各个重要脏器和多种组织，在心肾功能调节中发挥重要作用〔1〕。本文采用肾上腺髓质素基因敲除小鼠结扎单侧输尿管(UUO)制备肾间质纤维化实验动物模型，观察与细胞外基质沉积有密切关系的基质金属蛋白酶1(MMP1)及其基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)在基因敲除小鼠及野生小鼠的表达，并观察血管紧张素受体拮抗剂缬沙坦对UUO小鼠的保护作用，从而探讨肾上腺髓质素对肾间质纤维化实验动物的保护作用及其与血管紧张素受体拮抗剂的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　肾上腺髓质素基因敲除小鼠(AMKO)和野生小鼠(WT)，雌性，体重16～22 g，8周龄，由东京大学实验动物中心提供。

　　1.2 主要试剂

　　缬沙坦由北京诺华公司提供，MMP1、TIMP1抗体及原位杂交、SABC试剂盒均由武汉博士德生物有限公司提供。RTPCR试剂盒为Invitrogen Life Technogies产品。

　　1.3 肾间质纤维化模型建立

　　小鼠于实验前分别置于代谢笼里取尿，检测尿蛋白和尿红细胞，结果均为阴性者用于实验。可自由进食和饮水，温度条件控制在(22±1)℃，12 h光/暗循环，两种小鼠随机各分为假手术组、模型组和缬沙坦组，每组5只。小鼠以10%水合氯醛以30 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉，腹部切开，暴露左侧肾脏，分离输尿管，于中上1/3处结扎并剪断。假手术组分离输尿管后缝合腹部。治疗组于术前1 d开始给予缬沙坦10 mg·kg-1·d-1灌胃，模型组和假手术组每日给予等容积的生理盐水。所有动物于术后第6天断头处死，切取左肾，留取肾组织标本。按冠状位纵形剖开，置于4%多聚甲醛 (含0.1% DEPC) 溶液中固定，石蜡包埋。同时留取部分新鲜肾组织保留于-70℃冰箱中以备提取总RNA用于RTPCR。

　　1.4 观察指标及方法

　　1.4.1 组织学检查

　　取左侧肾组织，用4%的多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，以3 μm的石蜡切片，行HE、Masson染色，光学显微镜下观察病理改变。

　　1.4.2 MMP1、TIMP1免疫组化表达

　　采用免疫组织化学SABC法检测 (工作液浓度均为1∶70)。MMP1、TIMP1在组织中的表达半定量分析：任意选取40个高倍视野，将阳性信号分为0～4级，0级：无表达；1级：局部弱阳性表达；2级：局部中度表达或广泛弱阳性表达；3级：局部强阳性表达或广泛弱阳性表达；4级：广泛强阳性表达。以每个高倍视野平均得分标准作为比较。

　　1.4.3 MMP1、TIMP1原位杂交表达

　　切片厚度为6 μm，常规脱蜡至水。3% h3O2室温处理10 min，蒸馏水洗涤2次。切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃消化40 min (暴露mRNA核酸片段)；PBS洗3次，蒸馏水洗1次。滴加预杂交液，恒温箱40℃ 4 h，吸取多余液体，不洗。按每张切片20 μl杂交液加在切片上，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上，恒温箱42℃杂交过夜。揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5 min×2次，0.5×SSC洗涤15 min×1次，0.2×SSC洗涤15 min×1次。滴加封闭液，37℃封闭30 min，甩去多余液体，不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 60 min；0.5 mol/L PBS洗5 min×4次。滴加生物素化过氧化物酶，37℃ 20 min；0.5 mol/L PBS洗5 min×4次。AEC显色，水溶性封片剂封片。评分方法同前。

　　1.5 MMP1、TIMP1 mRNA检测

　　采用RTPCR检测。应用Trizol试剂提取肾组织总RNA，并按照逆转录试剂盒要求制备cDNA，随后进行PCR以扩增目的片段，βactin作为内参照，扩增引物序列如下：MMP1正义链：5′TGG ACC TGG AGG AAA TCT TGC3′，反义链：5′AGA GTC CAA GAG AAT GGC CGA3′；TIMP1正义链：5′ACT GCA GGA TGG ACT CTT GCA3′，反义链：5′TTT CAG AGC CTT GGA GGA GCT3′；βactin正义链：5′ TAC CGC TTC ACC ACC ACA GC3′，反义链：5′ AGG GAA GGC TGG AAA AGA GC3′。取cDNA 2 μl，加入引物2 μl、缓冲液5 μl、dNTP 5 μl、Taq酶1/8 μl，加双蒸水至50 μl。扩增条件为：变性：94℃，30秒；退火：55℃～59℃ 30 s；延伸：72℃ 30 s；30个循环。使用Gene Amp PCR系统9700(USA)。最后取20 μl扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，于紫外灯下拍照，将胶片上的反应条带在IBAS2000图像分析仪中扫描。MMP1、TIMP1、βactin相对含量用相同PCR反应中光带的强度表示。

　　1.6 统计学处理

　　数据以x±s表示，使用SPSS10.0统计软件，计数资料比较用秩和检验，两组均数比较用t检验。

　　2 结果

　　2.1 肾脏组织学改变

　　肾组织HE染色肾上腺髓质素基因敲除及野生小鼠假手术组均未见异常，模型组表现为近曲小管上皮细胞水肿、远曲小管扩张，上皮细胞坏死、脱落及细胞管型形成，大量炎性细胞浸润。缬沙坦治疗组略轻于模型组，但无明显差别。Masson染色显示：假手术组小鼠肾脏无异常；模型组肾组织切片表现为小管扩张，小管基底膜变薄，并出现了小管萎缩，间质胶原成分明显增多；缬沙坦治疗组胶原成分增多但较模型组为轻。与野生小鼠相比，基因敲除小鼠模型组胶原成分明显增多，经缬沙坦治疗有所改善。

　　2.2 MMP1、TIMP1免疫组化表达、分布及半定量分析

　　2.2.1 MMP1蛋白表达、分布及半定量分析

　　免疫组化结果显示野生小鼠及肾上腺髓质素基因敲除小鼠假手术组肾脏MMP1中度表达，主要位于肾小管上皮细胞；UUO后表达减弱，与假手术组相比有显著差异(P＜0.01)；给予缬沙坦治疗后，表达稍增强。两组小鼠相比，模型组和缬沙坦组基因敲除小鼠表达减弱但无显著性差别，见表1。表1 各组小鼠肾脏MMP1/TIMP1免疫组化、原位杂交结果及MMP1/TIMP1 mRNA表达比较(略)

　　2.2.2 TIMP1蛋白表达、分布及半定量分析

　　结果显示野生小鼠及基因敲除小鼠假手术组肾脏TIMP1呈中度表达；模型组表达明显增强，与假手术组相比有显著性差异(P＜0.01)；缬沙坦治疗组表达亦增强。两组小鼠相比，模型组与缬沙坦组基因敲除小鼠TIMP1表达均增强(P＜0.05)，见表1。表1 各组小鼠肾脏MMP1/TIMP1免疫组化、原位杂交结果及MMP1/TIMP1 mRNA表达比较(略)

　　2.2.3 MMP1/TIMP1比较

　　结果显示野生及基因敲除小鼠假手术组相比为1；野生小鼠模型组相比为0.56，基因敲除小鼠为0.42；野生小鼠缬沙坦组相比为0.72，基因敲除小鼠为0.76，说明在UUO诱导的肾间质纤维化实验中，存在MMP1/TIMP1的失衡，而这一失衡与肾上腺髓质素相关。

　　2.3 MMP1、TIMP1原位杂交表达、分布及半定量分析

　　2.3.1 MMP1原位杂交表达、分布及半定量分析

　　原位杂交测定MMP1基因表达，结果证实野生小鼠假手术组为中等强度表达，主要表达于小管上皮细胞，模型组和缬沙坦组均明显下调，模型组与假手术组相比有显著性差异(P＜0.01)。基因敲除小鼠假手术组呈中等强度表达，模型组和缬沙坦组均明显下调，两者无明显差别。两组小鼠相比，各组均无显著性差异，见图1、表1。表1 各组小鼠肾脏MMP1/TIMP1免疫组化、原位杂交结果及MMP1/TIMP1 mRNA表达比较(略)

　　2.3.2 TIMP1原位杂交表达、分布及半定量分析

　　检测TIMP1基因表达，结果显示野生小鼠及基因敲除小鼠假手术组呈弱表达，模型组及缬沙坦组均明显上调；模型组与假手术组相比有显著性差异(P＜0.01)。模型组基因敲除小鼠与野生小鼠相比有显著性差异(P＜0.05)，两缬沙坦组表达有差异但无统计学意义，见图2、表1。表1 各组小鼠肾脏MMP1/TIMP1免疫组化、原位杂交结果及MMP1/TIMP1 mRNA表达比较(略)

　　2.3.3 MMP1/TIMP1 mRNA比较

　　野生及基因敲除小鼠两假手术组相比为2.08；野生小鼠模型组相比为0.51，基因敲除小鼠为0.37；野生小鼠缬沙坦组相比为0.63，基因敲除小鼠为0.47，表明在mRNA水平由于UUO导致MMP1/TIMP1的失衡，且肾上腺髓质素基因敲除小鼠失衡更为显著。

　　2.4 MMP1、TIMP1mRNA表达及半定量分析

　　2.4.1 MMP1表达及半定量分析

　　RTPCR检测MMP1表达，结果显示野生及基因敲除小鼠MMP1表达较强，其中野生小鼠较肾上腺髓质素基因敲除小鼠稍强，但没有显著性差异；与假手术组相比，模型组MMP1表达明显下调，均有显著性差别(P＜0.05)，两缬沙坦组较模型组表达增强，基因敲除组有显著性差异(P＜0.05)，但野生小鼠组差异不显著，见图3、表1。表1 各组小鼠肾脏MMP1/TIMP1免疫组化、原位杂交结果及MMP1/TIMP1 mRNA表达比较(略)

　　2.4.2 TIMP1表达及半定量分析

　　RTPCR检测TIMP1表达，结果显示野生及基因敲除小鼠TIMP1表达较弱，肾上腺髓质素基因敲除小鼠表达强于野生小鼠，但没有显著性差异；与假手术组相比，模型组TIMP1表达明显上调，有显著性差别(P＜0.05)，两缬沙坦组较模型组表达减弱，基因敲除组有显坐性差异(P＜0.05)，但野生小鼠组差异不显著，见图3、表1。表1 各组小鼠肾脏MMP1/TIMP1免疫组化、原位杂交结果及MMP1/TIMP1 mRNA表达比较(略)

　　3 讨论
　　
　　肾上腺髓质素广泛分布于体内各种组织，肾脏不仅分泌肾上腺髓质素参与其在体内的生理活动，而且是其代谢的主要场所，是这种活性肽的分泌器官，同时又是作用的靶器官，在肾脏的生理功能和病理改变中起着重要的作用，我们曾采用肾上腺髓质素基因敲除小鼠，采用UUO方式制备肾间质纤维化实验动物模型，观察在基因缺失状态下肾脏细胞增殖、凋亡，细胞表型转化等在间质纤维化中的作用，结果证实基因敲除小鼠与野生小鼠相比，生理状态下，两者无明显差异，但间质损伤时，细胞增殖显著增加，细胞转化标志物的表达显著上调，相关的细胞因子如转化生长因子β1(TGFβ1)的表达也有明显增强，说明肾上腺髓质素在细胞的增殖、转化中发挥着重要的作用〔2，3〕。
　　
　　本研究结果显示肾脏损伤状态下，MMP1的表达减弱，TIMP1的表达增强，导致MMP1/TIMP1的失衡，而这种失衡在基因敲除小鼠中更为显著，说明肾上腺髓质素与MMP1/TIMP1的调控有关联。采用血管紧张素Ⅱ受体阻断剂进行治疗，可以部分减轻失衡，也说明两者之间有着交叉作用，但其机制需要进一步研究。
　　
　　细胞外基质的异常沉积是导致脏器硬化的主要病理改变，基质金属蛋白酶及其抑制物在其沉积和降解中发挥着调控作用，其中降解间质胶原酶的MMP1在间质纤维化中的作用尤为突出。尽管MMPs能降解除多糖以外的全部细胞外基质成分并以瀑布效应激活其家族，但其分泌及活化并不一定能降解靶器官的细胞外基质，这是由于其特异性抑制物TIMPs以及其他非特异性抑制剂所决定的，也就是说，在MMPs/TIMPs中，TIMPs起着决定性的作用。TIMPs除了抑制MMPs的活性外，还具有生长因子样特性，调控细胞的增殖与凋亡，如TIMP1抑制大鼠系膜细胞凋亡，TIMP2抑制细胞增殖，而TIMP3诱导细胞凋亡〔4，5〕。Engelmyer等〔6〕在大鼠实验性单侧输尿管梗阻引起的肾间质纤维化模型中检测到TIMP1明显增高，推测TGFβ1可诱导TIMP1表达，引起基质降解减少。本研究也证实肾间质损伤时，TIMP1的高表达在MMPs/TIMPs的调节中起着主要的作用，结合前期TGFβ1在UUO肾上腺髓质素基因敲除小鼠的高表达研究结果，说明肾上腺髓质素与抑制TGFβ1的表达有关，可以通过对TGFβ1的作用调控MMPs/TIMPs的失衡。

参考文献

　　1 Kitamura K，Kangawa M，Kawamoto M，et al.Adrenomedullin：a novel hypotensive peptide isolated from human pheochromacytoma〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1993；192(2)：55360.

　　2 许庆友，丁英钧，朱 立.肾上腺髓质素基因敲除小鼠单侧输尿管结扎肾脏αSMA表达特点及缬沙坦的作用〔J〕.中国药理学通报，2006；22(7)：81922.

　　3 韩 琳，陈志强，许庆友.肾上腺髓质素在肾间质纤维化实验小鼠肾脏细胞增殖中的作用〔J〕.中国药理学通报，2007；23(4)：4847.

　　4 Selman M，Ruiz V，Cabrera B，et al.TIMP1，2，3 and 4 in idiopathic pulmonary fibrosis.A prevailing nondegradative lung microenvironment〔J〕? Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2000；69(4)：61329.

　　5 Lin H，Chen X，Wang J，et al.Inhibition of apoptosis in rat mesangial cells by tissue inhibitor of metalloproteinase1〔J〕.Kidney Int，2002；62(1)：609.

　　6 Engelmyer E，Van GH，Edwards DR，et al.Differential mRNA expression of renal cortical tissue inhibitor of metalloproteinase1，2，and 3 in experimental hydronephrosis〔J〕.J Am Soc Nephrol，1995；5(9)：167583.