乳鼠及人肺原代成纤维细胞的分离培养

　　　　　　 作者：李丽娜 王华 张永胜 王丽颖 于永利 孙陆果

【摘要】 目的 建立体外原代培养乳鼠及人肺成纤维细胞的方法。方法 采用非胰酶消化组织块法培养乳鼠及人肺成纤维细胞，细胞长出组织块后经形态学检测确定是否为成纤维细胞。结果 乳鼠肺成纤维细胞需3～5 d可增殖形成单层，并进行第1次传代;人肺成纤维细胞30～35 d左右增殖形成单层，并进行第1 次传代。结论 非胰酶消化组织块法是一种可行的成纤维细胞培养方法。

【关键词】 肺;成纤维细胞;原代培养

　　　　 大量研究显示肺纤维化预后很差，大部分患者一旦被诊断为肺纤维化，其生存时间不超过5年〔1～3〕。针对肺纤维化的病理特点，肺成纤维细胞成为该研究的靶细胞之一，本文研究了人及乳鼠肺成纤维细胞的原代培养方法，为深入研究做准备。

　　1 材料与方法

　　1.1 组织来源 人肺组织来源于吉林大学第一医院胸外科因患肺癌行肺切除术的患者肺癌癌周组织，乳鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。

　　1.2 实验试剂 小牛血清购自天津TBD公司;6孔细胞培养板及50 ml塑料培养瓶购自Corning公司;DMEM及Hanks干粉购自Gibco公司;胰酶由Sigma公司生产，国内分装;青霉素及链霉素由东北制药生产。

　　1.3 人及乳鼠肺成纤维细胞的培养 将乳鼠断颈致死，置75%酒精泡2～3 s，取肺脏，置于盛有PBS的平皿中。用已高压消毒的眼科手术剪将脏器剪成小块(1 mm2)。取因患肺癌行肺切除术的患者肺癌癌周肺组织，用事先预热的Hank液冲洗后置于平皿中，用已高压消毒的眼科手术剪将组织块剪成小块(1 mm2)。将组织块置于6孔板中，每孔放置4～6块。滴入含20%小牛血清的DMEM培养液至刚没过组织块为止。细胞爬出组织块并形成细胞岛后弃除组织块。

　　1.4 细胞换液及传代 每4～6 d换液一次，待细胞长满6孔板后消化传代至培养瓶。

　　2 结 果

　　2.1 乳鼠肺成纤维细胞的培养 乳鼠肺成纤维细胞5 d左右即长满6孔板，进行第一次传代并转移至50 ml塑料培养瓶中，见图1。传至第3代冻存。

　　2.2 人肺成纤维细胞的培养 来自肺癌患者癌周正常肺组织的组织块培养3 d左右有成纤维细胞爬出组织块边缘，25 d细胞增多，32 d形成单层，进行第一次传代并将细胞转入50 ml塑料培养瓶中。传代3次后进行冻存，保存于液氮中。见图2。

　　图1 乳鼠肺成纤维细胞第1代图2 人肺成纤维细胞原代培养第1代

　　图3 原代培养肺成纤维细胞冻存前2.3 细胞形态观察倒置相差光学显微镜下观察 见图3。刚铺于6孔板的组织块无成纤维细胞长出，培养2～3 d细胞开始贴壁生长，呈铺路石样，后变为梭形，细胞在瓶壁逐渐展开、伸出伪足，变为多边形，核仁清晰;培养的细胞逐渐形成细胞簇或细胞单层。培养的肺成纤维细胞在3～50代无论细胞形态还是细胞活力都良好，在此期间可加各种处理因素进行实验研究。

　　3 讨 论

　　肺纤维化作为一种低治愈率高死亡率的疾病，其发病机制包含许多因素，但成纤维细胞增生和产生胶原是本病的重要环节和结局。在对肺纤维化的研究过程中，鼠肺成纤维细胞及人肺成纤维细胞成为实验必需。

　　随着细胞培养技术的发展，目前已建立了多种成纤维细胞培养方法。最常用的有酶消化法和组织块贴壁法。 其中酶消化法〔4〕原理是利用消化酶将细胞周边的细胞间质包括基质、纤维等消化去除，使细胞分散。由于消化法易受组织块的来源、大小、酶作用的时间和温度等多方面因素的影响，胰蛋白酶解离细胞时容易造成细胞破损，因此酶浓度、酶处理温度和处理时间至关重要，这点掌握不好，消化后细胞状态欠佳，死亡较多，贴壁需要较长时间。另外，得到的细胞中混杂较多杂细胞和其他杂质，需进一步分离。非胰酶消化组织块法是常用的、简便易行的原代培养方法，该方法在很大程度上保持了其原有组织结构，由于没有经过酶处理，其更接近生理状况下的细胞生长，有利于其适应体外培养环境〔5〕。与酶消化法比较，组织块贴壁法培养成纤维细胞更为简便，细胞成分更为单一。但组织块必须贴壁才会有细胞长出，所以组织块大小应适当，太小不易贴壁，太大细胞数量会减少。实验中发现组织块干燥时间最佳为2 h，时间太短容易脱落，干燥1 h贴壁不牢，加培养液和换液时均有组织块脱落;干燥2 h贴壁比较牢固，没有脱落，时间太长会影响细胞生长状态，干燥3 h细胞长出时间稍慢。已爬出成纤维细胞并形成细胞群落的组织块应弃除，避免其坏死或凋亡产生的某些细胞因子对原代细胞有所影响。另外，原代培养比较容易污染，操作时无菌观念要强，培养液和冲洗液均应加双抗。

参考文献

1 Hiwatari N，Shimura S，Sasaki T，et al.Prognosis of idiopathic pulmonary fibrosis inpatients with mucous hypersecretion〔J〕.Am Rev Respir Dis，1991;143：1825.

　　2 Gharaee Kermani M，Phan SH.Molecular mechanisms of and possible treatment strategies for idiopathic pulmonary fibrosis〔J〕.Curr Pharm Des，2005;11：394371.

　　3 Hunninghake GW.Antioxidant therapy for idiopathic pulmonary fibrosis〔J〕.N Engl J Med，2005;353：22857.

　　4 寇全安，张 涌，李裕强，等.兔成纤维细胞的分离与体外培养〔J〕.西北农业大学学报，1999;27(3)：1621.

　　5 Mio T，Nagai S，Kitaichi M，et al.Proliferative characteristics of fibroblast lines derived from open lung biopsy specimens of patients with IPF〔J〕. Chest，1992;102(3)：8327.