缺血预处理对心肌梗死大鼠心肌肝细胞生长因子表达的影响

　　　　 作者：邢邯英 李晓慧 野战鹰 赵晓云 张萍

【摘要】 目的 通过观察大鼠心肌梗死和远距缺血预处理后缺血心肌中肝细胞生长因子(HGF)基因表达的变化，探讨HGF在远距缺血预处理中的作用。方法 实验分组：① 急性心肌梗死组;②下肢缺血预适应组：夹闭双侧股动脉后再灌注，重复4次后结扎左前降支。③肾缺血预适应组：夹闭双侧肾动脉再灌注，重复3 次后结扎左前降支。④正常对照组。用evansTTC染色法区分梗死区和缺血区心肌，切取梗死区心肌及缺血区心肌并称重。用RTPCR法检测大鼠缺血区心肌HGF mRNA表达。结果 除了正常对照组外其他三组缺血程度无明显差异;而肾缺血预处理组心肌梗死程度(46.18%±6.15%)、下肢缺血预处理组梗死程度(46.92%±6.69%)较急性心肌梗死组(66.44%±13.68%)相比均降低约30%(P<0.05)。肾缺血预处理组及下肢缺血预处理组4、6、12 h HGF mRNA表达较急性心梗组各时间点降低(P<0.01)。结论 提示HGF可能是远距缺血预处理减少梗死区面积的机制之一。

【关键词】 急性心肌梗死;缺血预处理;肝细胞生长因子

　　　　 1996年Gho等发现将小肠或肾脏缺血15 min对闭塞冠脉60 min的心肌有保护作用，可显著缩小心肌梗死的面积。他们把这种保护作用称为远端缺血预处理〔1〕。寻找远端缺血预处理过程中关键性的引起心肌保护作用的内源性物质可能对预防和治疗心肌梗死有重要的意义。肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)具有抗凋亡、促血管新生、修复内皮细胞的功能等作用。本实验复制急性心肌梗死和肾及下肢缺血预适应大鼠模型，观察HGF在梗死心肌中的表达规律，进一步明确远距缺血预处理对心肌产生保护作用的机制，探讨HGF的生成规律，为临床防治缺血性心脏病提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 实验动物采用清洁级雄性健康成年SpragueDawley大鼠，体重250～300 g，由河北医科大学动物实验中心提供。

　　逆转录酶(AMVRT)和Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)购自美国Promega 公司;HGF 及βactin引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 动物模型的建立 采用大鼠心脏冠状动脉左前降支结扎法〔2〕制作心肌梗死模型：大鼠称重、麻醉后仰位固定，记录标准6导联心电图。气管插管，接小动物呼吸机。沿大鼠左侧第三、四肋间作一纵切口约1 cm，逐层打开胸壁，撕开心包，暴露心脏，在左心耳与肺动脉圆锥之间平左心耳下缘约3 cm处结扎冠状动脉左前降支，术毕逐层关胸。大鼠有自主呼吸后拔除气管内插管。以结扎线以下心肌颜色变暗及结扎冠脉20 min内心电图ST段、T波进行性抬高为成功结扎的指标。

　　1.2.2 实验分组 大鼠随机分为3组：①急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)组：结扎冠状动脉左前降支制作AMI模型;②肾脏缺血预适应(renal ischemic preconditioning，RIP)组：大鼠仰卧位，腹正中切口，游离肾蒂，分离双侧肾动脉，用无损伤动脉夹夹闭双侧肾动脉，夹闭5 min，开放5 min，共3个循环〔3〕。随后进行冠状动脉左前降支结扎复制AMI模型;③下肢缺血预处理 (limb ischemic preconditioning，LIP) 组：钝性分离双侧股动脉，用动脉夹夹闭双侧股动脉5 min，开放5 min〔4〕，共4个循环。随后进行结扎、复制AMI模型。④ 正常对照组：未作任何处理。除正常对照组外均在操作结束后2、4、6、12 h处死大鼠。保证每组成功实验动物例数为8例。

　　1.2.3 伊文思三苯基氯化四氮唑(evansTTC)双染色法测定梗死程度〔5〕 在结扎左冠状动脉12 h后，重新麻醉大鼠，固定，开胸，用止血钳钳夹升主动脉，由主动脉根部逆行注入1%伊文思蓝，正常心肌为蓝色，缺血区为苍白色。等缺血区明显后，将心脏取出，于生理盐水中冲洗，并剪去心房和右室，滤纸吸干表面水分，置-20℃冻存。0.5 h后取出，沿心肌横轴切5～6片，放入2%TTC中，37℃孵育30 min。可见存活心肌被染成蓝色，缺血心肌为砖红色，梗死心肌为苍白色。仔细分离以上三种心肌，用电子天平称重，分别进行记录。计算梗死心肌与缺血心肌和梗死心肌之和的重量百分比来表示梗死程度，同时计算缺血区心肌占左室心肌百分比来表示心肌缺血程度。

　　1.2.4 RTPCR法测心肌组织HGF基因表达 取各组大鼠结扎线下缺血区心肌100 mg，液氮中速冻，-80℃冰箱保存待用。Trizol一步法提取总RNA，反转录后行HGF和内参照βactin基因的PCR扩增。HGF引物序列：上游 5′gag cca gac gct agc aag tt3′，编号CW14994，下游5′aat ctg agc ctt cag gtc cat3′，编号CW14995。扩增片段长度425 bp;大鼠βactin为内参照，βactin引物序列：上游 5′gcc atg tac gta gcc atc ca3′，编号BW12335，下游 5′gaa ccg ctc att gcc gat ag3′，编号BW12336，扩增片段长度为375 bp。扩增产物进行1.5%琼脂糖电泳，用凝胶图像分析系统分析结果。HGF扩增产物与βactin扩增产物密度扫描之比作为HGF的相对表达量。

　　1.3 统计学分析 实验数据均以x±s表示，采用SPSS13.0统计软件处理:各组数据均进行正态性检验和方差齐性检验，符合后多组间比较采用单因素方差(OneWay ANOVA)分析。

　　2 结 果

　　2.1 梗死程度 结扎左冠状动脉前降支12 h后，RIP组、LIP组较AMI组相比其缺血程度无明显差异(P>0.05);而RIP组心肌梗死程度(46.18%±6.15%)、LIP组梗死程度(46.92%±6.69%)较AMI组(66.44%±13.68%)相比均降低大约30%，降低有明显差异(P<0.05)。RIP组、LIP组梗死程度相比差异无统计学意义(P>0.05)。

　　2.2 心肌组织HGF基因表达 AMI组随时间延长HGF mRNA表达(1 h:0.52±0.12;2 h：0.56±0.18;4 h：0.61±0.16;6 h:0.68±0.11;12 h：0.71±0.18)逐渐上升，较正常对照组(0.47±0.11)相比4 h、6 h、12 h升高有明显差异(P<0.05);RIP组各时间点(2 h:0.46±0.15;4 h：0.31±0.06;6 h：0.35±0.08;12 h：0.31±0.06)及LIP组各时间点HGF mRNA表达(2 h：0.47±0.07;4 h：0.40±0.08;6 h：0.47±0.17;12 h：0.41±0.11)较AMI组各时间点相比4 h、6 h、12 h均降低，且有显著差异(P<0.01)。RIP组，LIP组梗死程度相比差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

　　图1 各组βactin和HGF RTPCR扩增产物的比较

　　3 讨 论

　　本实验采用大鼠心脏冠状动脉左前降支结扎法制做心肌梗死模型，使用多导心电监护仪连续心电监测。该动物模型的制作方法方便、有效、确切，观察结果明显。梗死4 h肉眼可见明显梗死区。采用动脉夹夹闭动脉的方法进行预处理，是现在大部分文献采用的方法，效果确切。evansTTC染色后，进一步验证了心梗模型制作成功及缺血预处理对心肌的保护作用。

　　近年研究发现HGF是一种特异的促内皮细胞生长因子，具有很强的促血管内皮细胞有丝分裂、抑制细胞凋亡与组织重构作用，是一种抗损伤修复因子〔6～8〕。 HGF作为一种对心肌有明显保护作用的细胞因子，其在缺血预处理中的表达值应该是上升的。但在本实验中，RIP组、LIP组心肌梗死后心肌组织HGF mRNA升高不明显，较单纯心梗后各时间点相比均有明显的降低。说明远距缺血预处理抑制了心肌HGF基因的表达。远距预处理由于其对心肌的保护作用，使心肌的梗死面积缩小，心梗后心肌组织中HGF表达的升高可能同缺血预处理时HGF表达降低的机制不全相同。Hayashi等〔9〕发现缺氧本身可以抑制HGF的生成，可能是由于缺氧以后促进了HGF的抑制物转化生长因子(TGFβ)的生成及缺氧后cAMP浓度降低的缘故。Onimaru等〔10〕发现纤维细胞生长因子(FGF2)会促进缺氧情况下HGF的表达，远距缺血预处理会影响到心肌组织中FGF7、FGF11的表达〔11〕，是否远距缺血预处理中HGF的表达抑制与FGF有关，需要进一步研究。此外，心梗后的应激反应使内皮细胞产生各种炎性介质，造成炎性介质肿瘤坏死因子(TNF)α、IL  1β大量释放入血，可以诱导HGF的分泌，远距缺血预处理后心肌损伤减小，炎性因子释放减少，TNFα合成受抑制，从而抑制了HGF的生成呢?或者是由于预处理后心肌梗死程度减轻，而HGF作为一种损伤所诱导的细胞因子相应的表达降低了?HGF的基因表达和作用机制非常精密和复杂，在疾病的不同阶段可能受不同的病理生理机制调节。HGF在远距缺血预处理中的作用，需要进一步研究证实。

　　尽管本研究成功复制了大鼠AMI和远距缺血预处理的模型，但用的是正常大鼠建立的实验模型。AMI患者是在多年动脉粥样硬化的基础上发病的，其动脉内膜已造成功能性损伤，内皮细胞表面已发生变化。巨噬细胞氧化低密度脂蛋白分泌及合成FGF，IL1等，而且在稳定型心绞痛的病人中，血清HGF浓度较正常人已有升高趋势，不过没有统计学意义，在AMI及不稳定型心绞痛的病人，血清HGF浓度较正常人都有升高〔12〕。所以，在冠状动脉粥样硬化基础上发生的AMI中，其HGF的基因表达只能以本实验作为参考，但HGF作为心血管的保护因素，促进内皮细胞的分裂、抗凋亡等作用是可以肯定的。在大鼠远距缺血预处理的心肌中，虽然HGF的基因表达受到抑制，但仍参与了急性心肌缺血的发病，而且有可能是远距缺血预处理减少梗死面积的机制之一。

参考文献

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