bFGF对拟血管性痴呆小鼠学习记忆及海马5HT和DA的影响

　　　　　　 作者：曲娴 李春颖 苏畅 李冰

【摘要】 目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对拟血管性痴呆（VD）小鼠学习记忆的影响及其机制。方法 清醒小鼠反复脑缺血再灌注法建立VD动物模型；造模后给予bFGF干预治疗；采用跳台法、避暗法及Morris水迷宫检测小鼠的学习记忆能力，用荧光分光光度法检测脑组织5羟色胺(5HT)和多巴胺(DA)含量，HE染色观察病理形态学变化。结果 bFGF组小鼠学习记忆能力提高(P＜0.01)；海马5HT和DA含量增加(P＜0.05，P＜0.01)。结论 bFGF通过调节脑神经递质5HT和DA含量改善拟VD小鼠学习记忆能力。

【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子；血管性痴呆；学习记忆；5羟色胺；多巴胺

　　有研究认为65岁以上的脑卒中幸存者中，大约1／3于发病后3个月内出现血管性痴呆（VD）〔1〕。在我国，VD可能是老年期痴呆中最常见的形式〔2〕。但其发病的确切病理机制尚不明了，临床干预手段缺乏特异性〔3〕。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是神经营养因子的一种，对神经元的存活、生长发育、分化、再生和功能维持具有不可替代的调节作用〔4〕。大量的研究已肯定其对神经保护的作用〔5，6〕。而bFGF对VD引起的单胺类递质改变的研究未见报道。为此，本实验在制备VD模型小鼠的基础上采用bFGF进行干预治疗，并检测VD小鼠学习记忆能力、海马5羟色胺(5HT)和多巴胺(DA)含量，旨在探讨bFGF治疗VD的可能机制，为临床治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与试剂

　　昆明种小鼠，体重（30.0±3.12）g，雌雄兼用，由长春高新区医学实验动物研究中心提供，合格证号：SCXK（吉）20072008。bFGF注射液由Peprotech提供。DA、5HT均由Sigma公司提供。

　　1.2 动物模型制备及治疗方法

　　将动物随机分为正常组、假手术组、VD模型组（简称“模型组”），bFGF干预组（简称“bFGF组”）。参照文献采用清醒小鼠反复脑缺血再灌注法建立VD动物模型〔7〕。清醒小鼠仰位固定，行颈部切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用。模型组和bFGF组固定拉紧丝线阻断血流，10 min后松线使血液再灌注20 min，如此反复3次。假手术组只分离双侧颈总动脉，套丝线扣，但不阻断血流。术后每日肌注青霉素0.2万U，连续3 d。bFGF组给予bFGF 100 μg/kg溶于生理盐水腹腔注射，于手术后首次即刻给药，以后每日1次，连用7 d〔8〕。正常组、假手术组、模型组给予等体积生理盐水腹腔注射，每日1次，连续注射7 d。

　　1.3 跳台实验

　　小鼠置跳台仪中，适应环境3 min后，底部栅板通电，记录小鼠跳上平台的时间（反应期）和5 min内小鼠遭受的电击数（错误次数）作为学习成绩；24 h后将小鼠放于平台上，底部栅板通电，记录小鼠跳下平台的时间（潜伏期）及5 min内的错误次数，作为记忆成绩。电压36 V，反应期、潜伏期指标以秒（s）为单位。测验时若小鼠停留在台上超出5 min，将其取下放入箱内，尾对平台，给予电刺激，记录潜伏期。

　　1.4 避暗法

　　将小鼠放入明室中，在箱内自由活动3 min。3 min内不进入暗室者剔除（预选时不通电）。1 h后正式进行学习训练，记录小鼠进入暗室遭受电击所需时间为潜伏期，并记录5 min内遭电击次数（错误次数）作为学习成绩；24 h后重复上述过程，记录潜伏期和错误次数作为记忆成绩。电压为36 V，潜伏期指标以秒（s）为单位。

　　1.5 Morris水迷宫实验

　　1 w后进行Morris水迷宫实验测试。采用Morris水迷宫图像分析系统，在直径80 cm圆形水池中设一低于水面1 cm透明站台，水温（25±2）℃，行为测试在安静环境内进行6 d。前5 d进行定位航行实验，将小鼠从东、南、西、北4个入水点背对站台轻轻放入水池，同时开始记录小鼠自入水到找到平台所需时间即逃避到平台上的潜伏期，每次间隔30 s。4次潜伏期时间的平均值作为当日最终潜伏期时间作最后统计。如果小鼠在120 s内未找到平台，其潜伏期按120 s计算。第6天进行空间探索实验，将水迷宫中的平台撤出，小鼠从平台的对角线处放入，记录小鼠在平台所在象限的时间即穿越有效区的时间和120 s内穿越平台的次数。

　　1.6 5HT和DA的检测

　　将小鼠迅速断头、取脑，放入预先冰冷的生理盐水中，去除脑膜和血管，分出海马，称重后加入预先冰冷的加入少量酸化正丁醇的玻璃匀浆器中，研磨制成匀浆，4℃ 3 000 r/min离心15 min，取上清，用荧光分光光度法测5HT和DA。

　　1.7 HE染色

　　水合氯醛麻醉后，迅速剖开胸腔暴露心脏，剪开右心耳，夹持心尖，自心尖左侧剪开左心室，将大隐静脉穿刺针经左心室插入升主动脉，灌注生理盐水，待血色变淡后，继以4%多聚甲醛（4℃）灌注固定，直至动物呈僵硬状态。原位静置1 h后取脑，用上述固定液后固定。取视交叉至乳头体组织，常规石蜡包埋，冠状切片，厚度8 μm，进行常规HE染色，程序如下：石蜡切片常规脱蜡下行至蒸馏水中待染；切片置苏木素染液5 min，自来水洗去多余的染料；切片放入盐酸酒精中数秒钟，水洗；切片入氨水溶液中至细胞核变蓝；将返蓝的切片充分水洗，去掉碱性物质，然后入1%伊红水溶液中5 min，洗去多余的伊红；显微镜下观察核浆染色对比清晰后梯度酒精脱水、封片。光镜下观察病理形态学变化。

　　1.8 统计学处理

　　数据表达采用x±s，采用t检验比较分析。应用SPSS11.0软件进行统计学处理。

　　2 结果

　　2.1 bFGF对拟VD小鼠跳台实验的影响

　　与正常组比较，假手术组小鼠学习训练和记忆测试中的各项指标相近，组间比较无显著性差异(P＞0.05)；模型组小鼠学习训练中反应期延长（P<0.01），错误次数增加（P<0.01）；记忆测试中潜伏期缩短（P<0.01），错误次数增加（P<0.01）。与模型组相比，bFGF组小鼠学习训练中反应期明显缩短（P<0.01），错误次数减少（P<0.01）；记忆测试的潜伏期延长（P<0.01），错误次数明显减少（P<0.01）。见表1。表1 bFGF对拟VD小鼠跳台实验的影响(略)

　　2.2 bFGF对拟VD小鼠避暗实验的影响

　　与正常组比较，假手术组小鼠潜伏期，错误次数无显著性差异(P＞0.05)；学习训练中，与正常组比较，模型组小鼠潜伏期延长（P<0.01），错误次数明显增加（P<0.01）；与模型组比较，bFGF组潜伏期缩短（P<0.01），错误次数明显减少（P<0.01）。在记忆测试中，与正常组比较，模型组潜伏期明显缩短、错误次数明显增多（P<0.01）；与模型组比较，bFGF组潜伏期明显延长，错误次数明显减少（P<0.01）。见表2。表2 bFGF对拟VD小鼠避暗实验的影响(略)

　　2.3 bFGF对拟VD小鼠Morris水迷宫的影响

　　定位航行实验：各组小鼠随着训练天数的增加，寻找平台的潜伏期明显缩短。但与正常组比较，假手术组小鼠寻找平台的潜伏期无显著性差异(P＞0.05)，模型组小鼠寻找平台的潜伏期显著延长（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组小鼠比较，bFGF组小鼠寻找平台的潜伏期显著缩短（P＜0.01）。空间探索实验：与正常组比较，假手术组小鼠穿越有效区时间以及穿越平台的次数无显著性差异(P＞0.05)，模型组小鼠穿越有效区时间明显缩短（P＜0.01），穿越平台的次数减少（P＜0.01）；与模型组小鼠比较，bFGF组小鼠穿越有效区的时间延长（P＜0.05），穿过平台的次数增多（P＜0.01）。见表3。表3 bFGF对拟VD小鼠寻找平台潜伏期及空间探索实验的影响(略)

　　2.4 bFGF对拟VD小鼠DA和5HT的影响

　　与正常组比较，假手术组小鼠海马组织5HT和DA含量无显著性差异(P＞0.05)，模型组小鼠脑海马组织5HT和DA含量明显低于正常组（P<0.01）；bFGF组5HT和DA含量均高于模型组（P<0.05，P<0.01），见表4。表4 bFGF对拟VD小鼠海马内单胺类神经递质的影响(略)

　　2.5 海马组织CA1区HE染色观察

　　正常组：小鼠海马 CA1 区锥体细胞核大而圆，核仁明显，细胞排列较致密整齐，锥体细胞可见多层。假手术组：与正常组无明显差别。VD 模型组：小鼠海马 CA1 区锥体细胞稀疏，层次不清楚；有部分细胞缺失；有的细胞旁有空染区，出现核固缩、胞质浓染、胞体变小。bFGF组：小鼠海马组织 CA1 区锥体细胞排列尚整齐，层次尚清楚；较少见核固缩现象。

　　3 讨论
　　
　　脑血管病所致脑组织反复缺血再灌注和长期慢性脑灌注不足是VD的主要原因〔9〕。本实验首选采用清醒小鼠反复结扎双侧颈总动脉的方法建立VD模型。目前多用Morris水迷宫检验空间学习能力和参考记忆力，跳台实验和避暗实验作为一次性训练被动回避式条件反射方法，能够比较客观地反映动物经过一次电击刺激后记忆获得和巩固情况。本研究通过跳台实验、避暗实验和Morris水迷宫实验证明模型小鼠的被动回避反应能力和空间分辨能力均下降，学习、记忆功能明显受损，同时光镜下观察模型组小鼠脑组织海马CA1区出现病理形态学的改变，均说明此模型是较为理想的VD动物模型。bFGF组学习记忆能力明显高于模型组，表明bFGF能够明显改善VD小鼠的智能。在VD的发病中，神经递质的改变对疾病的发展程度及预后相当重要。已有资料表明，VD发病过程中大脑海马的神经递质明显减少，尤其是单胺类神经递质减少与VD的智力下降密切相关。多数学者认为中枢神经系统缺血期间单胺的合成及降解均受抑制，同时神经末梢突触对单胺的贮存和重摄取功能也几乎丧失，这就使缺血前已合成的神经递质大量释放进入细胞间隙，最后这些递质一部分被降解，一部分被带入脑脊液及血液中，致使脑组织中递质含量下降。也有学者认为缺血早期神经元受到缺血的刺激，对神经递质的合成及释放增加，随着神经元破坏加重，其合成及释放又被抑制。本实验中VD小鼠脑组织海马区DA、5HT含量明显下降，这与其学习记忆能力下降基本一致〔10〕，bFGF组海马组织5HT和DA含量明显提高。本研究显示，bFGF可以通过上调海马组织5HT和DA含量改善VD小鼠学习记忆能力，其具体机制尚待进一步研究。

参考文献

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　　10 李世英，张文义，郑素霞，等.当归芍药散对拟血管性痴呆小鼠脑海马5HT及DA含量的影响〔J〕.中国中医急症，2008，17（9）：125960.