顺铂对结肠癌细胞株HCT116凋亡及存活素表达的影响

　　　　　　作者：陈贻平 欧阳范献 翁敬飚

【摘要】 目的 探讨结肠癌细胞株HCT116对化疗药物顺铂不敏感的原因与机制。方法 观察不同浓度顺铂(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/ml) 对HCT116细胞凋亡及低浓度顺铂对抗凋亡基因存活素(survivin)mRNA及蛋白表达的影响，用流式细胞仪检测凋亡率;荧光定量PCR检测survivin mRNA的表达;Western印迹法检测survivin蛋白的表达。结果 高浓度 (5.0、10 μg/ml)顺铂对HCT116细胞有较强促进凋亡作用，而低浓度 (0.1、0.5、1.0 μg/ml)顺铂干预24 h后，促进细胞凋亡的作用不明显;HCT116细胞在1.0 μg/ml顺铂作用下， survivin mRNA及蛋白表达在24 h均有明显升高。结论 顺铂可诱导HCT116细胞的凋亡，但该细胞对低浓度顺铂不敏感。survivin表达增高可能是HCT116细胞对顺铂细胞毒性药物作用不敏感的原因之一。

【关键词】 顺铂;细胞凋亡;存活素

　　　　结肠癌化疗疗效尚不令人满意，原因主要为癌细胞对化疗药物作用的敏感性差〔1〕。为此，本实验将常用化疗药物顺铂(cisplatin)设为5个不同作用浓度，通过检测HCT116细胞在顺铂作用过程中的凋亡情况及相关基因存活素(survivin)的表达变化，探讨结肠癌细胞对细胞毒性药物顺铂作用不敏感的原因及可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂 DMEM、Trizol(Invitrogen公司)，胎牛血清(四季青公司)，AnnexinⅴPI细胞凋亡检测试剂盒、蛋白定量试剂盒、蛋白Marker及ECL发光试剂盒(凯基公司)，青链霉素、胰酶(吉诺公司)，荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)，引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。survivin抗体(Santa Cruz公司)。内参βactin、辣根过氧化物标记二抗(北京中山公司)。细胞购于生科院细胞所。顺铂为山东齐鲁制药厂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 HCT116细胞用DMEM培养液(含10%胎牛血清，100 U/L青霉素，100 U/L链霉素)，于37℃、5% CO2培养箱中培养。

　　1.2.2 AnnexinⅤPI检测细胞凋亡 收集1×105细胞PBS洗涤2次，以200 μl的Binding Buffer悬浮细胞;加入5 μl AnnexinⅴFITC混匀，加入5 μl PI混匀。室温避光15 min，流式细胞仪检测。

　　1.2.3 Trizol提取细胞的总RNA 6孔培养板每孔中加入1 ml的Trizol裂解细胞，反复吹打3 min后将细胞裂解物移入1.5 ml的EP管内。静置5 min，每1 ml的Trizol加0.2 ml氯仿，盖紧样品管盖，用力摇晃EP管15 s并将其置于室温下孵育5 min。4℃ 4 200 r/min冷冻离心15 min。将水样层移至一干净的EP管中，加入等体积的异丙醇，混合后将样品在冰盒上放置30 min使RNA析出，4℃ 4 200 r/min的离心力高速冷冻离心10 min。 移去上层悬液，用1 ml 75%乙醇再洗涤RNA1次，将75%乙醇移去，简单干燥RNA沉淀，用无RNA酶水溶解RNA，并在56℃孵育5 min。1∶50稀释测定浓度，样品保存于-80℃。

　　1.2.4 RT PCR检测survivin mRNA的表达 引物序列为survivin上游：5′TTCGTCCGGTTGCGCTTTCC3′，下游：5′TCGATGGCACGGCGCACTTT3′;βactin上游：5′TGGCACCACACCTTC TACAAT3′，下游：5′AGAGGCGTACAGGGATAGCA3′。反应体系使用TaKaRa公司试剂盒，反转录反应条件42℃ 15 min;85℃ 5 s;RTPCR反应条件95℃ 10 s，1个循环;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，45个循环。F(Fold)=2△△CT， △△CT=(CT.TargetCT.Actin)treated-(CT.TargetCT.Actin)control。

　　1.2.5 全细胞蛋白提取 冰预冷的PBS轻轻洗涤瓶中贴壁的细胞，6孔培养板每孔中加入100 μl细胞裂解液融解细胞，同时用细胞刮子收集细胞，以上在冰上操作;细胞裂解液进行离心沉淀，取上清测其总蛋白浓度，剩余冻存于-70℃待用。

　　1.2.6 Western印迹检测survivin蛋白的表达 提取总蛋白进行 SDS聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜5 min×4，二抗室温孵育1 h，ECL发光试剂盒显色，曝光。

　　1.3 统计学方法 数据均采用SPSS11.5 软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，多组间的均数比较采用oneway ANOVA。

　　2 结 果

　　2.1 顺铂对HCT116凋亡的影响 HCT116细胞以不同浓度顺铂处理24 h，结果显示高浓度顺铂(5.0、10.0 μg/ml)组细胞凋亡率分别为(10.08±0.57)%、(18.25±1.44)%，与对照组细胞凋亡率(3.98±0.38)%相比明显增加(P<0.05);而低浓度顺铂(0.1、0.5、1.0 μg/ml)组细胞凋亡率分别为(3.96±0.14)%、(4.17±0.40)%、(5.17±0.50)%，与对照组相比无明显差异(P>0.05)。提示高浓度顺铂可以诱导HCT116细胞凋亡，但低浓度顺铂诱导凋亡作用不明显。

　　2.2 顺铂对survivin mRNA表达的影响 低浓度(1.0 μg/ml)顺铂对HCT116细胞的凋亡无明显影响。但用1 μg/ml顺铂处理细胞6、12、24 h，RTPCR检测survivin mRNA水平分别增加到1.69、2.45及3.41倍，较对照组细胞survivin mRNA表达显著增加(P<0.05)。

　　2.3 顺铂对survivin 蛋白表达的影响 低浓度(1.0 μg/ml)顺铂处理HCT116细胞6、12、24 h，灰度值分析显示顺铂处理组survivin蛋白较对照组细胞分别增加到1.52、1.86、1.98倍。如图1所示，低浓度顺铂处理明显增加survivin蛋白的表达。

　　图1 顺铂处理6、12、24 h HCT116细胞

　　survivin蛋白表达变化

　　3 讨 论

　　临床上大剂量化疗药物毒副作用大，患者常不能耐受，小剂量药物作用又不明显。因此探讨化疗药物敏感性机制，是临床上克服低剂量化疗药物效果不佳急需解决的问题。

　　Survivin广泛表达于机体胚胎及恶性肿瘤组织中〔2〕，在结肠癌病理组织中阳性率高达64.5%～85%〔3〕，其高表达与病人对及肿瘤组织的转移、侵润及化疗药物的敏感性等生物行为密切相关〔4～6〕。survivin作用机制与其他IAP家族蛋白相似，通过抑制caspase活性，从而抑制了细胞的凋亡〔7～9〕。本实验中发现结肠癌细胞株HCT116对低剂量化疗药顺铂不敏感可能与凋亡抑制蛋白survivin高表达有关。

　　顺铂为临床常用的化疗药物，可以诱导细胞的凋亡〔10〕。本研究发现HCT116细胞在经顺铂处理时，仅大剂量(5.0、10.0 μg/ml)可诱导细胞的凋亡，但该浓度已远远大于临床最大用药剂量血药浓度。而低剂量(0.1、0.5、1.0 μg/ml)对结肠癌细胞HCT116作用不显著。进一步实验发现低剂量顺铂处理的HCT116 survivin在mRNA及蛋白水平上都有显著增加。顺铂诱导凋亡的机制是通过caspase3的活化进行，而survivin则可以通过抑制caspase3的活化来抑制细胞凋亡，由此可以认为survivin表达增加可以抵制顺铂诱导的细胞凋亡，使肿瘤细胞对顺铂不敏感。

　　本实验证实顺铂可诱导结肠癌细胞HCT116的凋亡，但低浓度顺铂对该细胞作用不敏感，这可能与低剂量顺铂使HCT116细胞中survivin表达增高有关。

参考文献

1 Johnstone RW，Ruefli AA，Lowe SW. Apoptosis：a link between cancer genetics and chemotherapy〔J〕.Cell，2002;108(2):15364.

　　2 Stanilov N，Miteva L，Mintchev N，et al.High expression of Foxp3，IL23p19 and survivin mRNA in colorectal carcinoma〔J〕.Int J Colorectal Dis，2009;24(2):1517.

　　3 Kawasaki H，Toyoda M，Shinohara H.Expression of surviving correlates with apoptosis，proliferation，and angiogenesis during human colorectal tumor genesis〔J〕.Cancer，2001;91 (11):202632.

　　4 Chiou SK，Jones MK，Tarnawski AS.Survivin an antiapoptosis protein：its biological roles and implications for cancer and beyond〔J〕.Med Sci Monit，2003;9(4):259.

　　5 Li F.Role of survivin and its splice variants in tumorigenesis〔J〕.Br J Cancer，2005;92(2):2126.

　　6 Mita AC，Mita MM，Nawrocki ST，et al.Survivin：key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics〔J〕.Clin Cancer Res，2008;14(16)：50005.

　　7 Altieri DC.Survivin in apoptosis control and cell cycle regulation in cancer〔J〕.Prog Cell Cycle Res，2003;5(3):44752.

　　8 Hunter AM，LaCasse EC，Korneluk RG.The inhibitors of apoptosis (IAPs) as cancer targets〔J〕.Apoptosis，2007;12(9):154368.

　　9 Chen XX，Lai MD，Zhang YL，et al.Less cytotoxicity to combination therapy of 5fluorouracil and cisplatin than 5fluorouracil alone in human colon cancer cell lines〔J〕.World J Gastroenterol，2002;8(5):8416.

　　10 Altieri DC. Survivin and apoptosis control〔J〕.Adv Cancer Res，2003;88(1):3152.