骨雌激素对ApoE基因敲除小鼠骨保护素和RANKL的影响

【摘要】 目的 观察雌激素对去卵巢C57BL/6J 小鼠股骨内骨保护素(OPG)和RANKL的影响。方法 采用双侧卵巢切除术制备骨质疏松(OP)动物模型，1 w后雌激素组开始每周腹腔注射苯甲酸雌二醇(EB)2次，模型组(E2组)注射同等量的橄榄油。6 w后应用免疫组化法观察各组小鼠股骨内OPG、RANKL的变化。结果 两组小鼠股骨内OPG和RANKL的表达无明显差异(P>0.05)。结论 雌激素不能通过增加ApoE基因敲除小鼠股骨中OPG和RANKL的表达而发挥抗OP作用。

【关键词】 骨质疏松;雌激素;OPG;ApoE

　　　　 骨质疏松(Ostoporosis，OP)已经成为中老年人常见的全身骨代谢性疾病，尤其以绝经后妇女多见，故有关雌激素与OP的相关研究已成为热点。大量的基础研究已肯定了雌激素的保护作用，但其作用机制仍不明〔1，2〕。近年来随着骨保护素(OPG)的发现，对OPG/RANK/RANKL系统的研究受到关注，国内外研究表明OPG可与RANKL结合抑制破骨细胞(OC)形成和活化，发挥抗破骨作用。另有人提出OP可能与遗传因素有关，因为遗传因素决定了每个人的最大骨密度，但关于此方面研究甚少，尤其是关于载脂蛋白E(apolipoprotein，ApoE)基因的研究。本文利用ApoE基因敲除鼠进行相关研究，试图从遗传角度探讨OP的发病机制，为OP的药物开发提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与分组 挑选健康、活跃的C57BL/6J ApoE基因敲除雌鼠20只，鼠龄12 w，体重20 g左右，北京实验动物中心提供，随机分为模型组(ApoE组)、雌激素组(E2组)，每组10只。

　　1.2 动物模型制作 10%水合氯醛(0.3～0.33 ml/100 g体重)腹腔麻醉，行双侧卵巢切除术。术中注意无菌操作，皮肤切口给予少许青霉素粉剂，缝合切口。第2周雌激素组开始肌注苯甲酸雌二醇(EB)0.28 mg·kg-1·3 d-1，模型组均注射同等量的橄榄油，至第6周末。

　　1.3 实验方法 6 w后对实验动物做如下处理：10%水合氯醛(0.3～0.33 ml/100 g体重)麻醉后小鼠仰卧固定，快速开胸暴露心脏剪开右心耳，进行心脏放血，取右侧股骨，剔除其软组织，放入4%甲醛中固定。24 h后，用PBS漂洗4～5 h。常规梯度酒精脱水，二甲苯透明后，浸蜡、石蜡包埋，制成蜡块，每只鼠在靶区附近连续切片，片厚为4～5 μm，石蜡切片脱蜡和水化后，采用免疫组化方法(SP法)，检测各组小鼠股骨内OPG和RANKL的变化，并结合图像分析仪进行分析。

　　1.4 结果判断 应用IPT高清晰度彩色病理图文报告分析系统，对股骨内的OPG/RANKL免疫组织化学反应做定量测定：两组动物每只取切片10张，每一张切片随机顺序测试骨细胞5个视野，测其阳性细胞数;每张切片取5个视野的均值，每只动物的每个指标取10张切片的均值。

　　1.5 统计学处理 应用SPSS11.0统计软件进行完全随机方差分析，并进行两两比较，实验数据以x±s表示。

　　2 结 果

　　OPG、RANKL免疫反应阳性细胞在胞膜、胞浆、核膜上均可见到，主要分布在骨细胞胞浆内，胞浆染色呈深棕色而且均匀，见图1、图2。两组小鼠股骨内OPG、RANKL阳性细胞数见表1，两组小鼠股骨内OPG阳性细胞数比较无显著性差异(t=0.618，P>0.05);两组小鼠股骨内RANKL阳性细胞比较也无显著性差异(t=0.110，P>0.05)。说明ApoE基因敲除后雌激素替代不能减少OPG/RANKL的丢失。表1 两组小鼠股骨内OPG、RANKL阳性细胞数

　　3 讨 论

　　近年来国内外的许多研究表明OPG具有抑制OC形成、分化、存活、活化并诱导OC凋亡的功能，且其功能与RANKL密切相关。本课题组曾利用去卵巢C57BL/6J鼠，采用免疫组化法对雌激素的OPG/RANKL机制进行了研究〔3〕，结果发现：去卵巢组股骨内OPG和RANKL的表达与对照组和补充雌激素组相比明显下降。研究结果提示：当雌激素缺乏时，OC前体细胞数和OC数量增加，延长了OC的生存时间，而RANK是OC表面介导RANKL生物活性的惟一受体，由成骨细胞(OB)分泌的OPG则是RANKL的特异性抑制物，OPG作为伪受体与RANKL结合，阻止了RANKL与RANK的结合，从而抑制OC的成熟。而补充雌激素后OPG和RANKL的表达明显上升，说明雌激素可通过增加股骨中OPG和RANKL的表达，抑制破骨性骨吸收，对去卵巢鼠的OP有明显的治疗作用，与以往的研究相符，揭示了雌激素的OPG/RANKL保护作用机制。

　　遗传因素决定了每个人的最大骨密度，故有人提出遗传因素与OP有关，并对多项遗传基因进行了研究 〔4，5〕。有研究表明携带ApoE4者衰老较快，主要表现为脑老化，容易导致老年性痴呆，是否ApoE同样也可导致骨老化而致OP?近年来关于ApoE与OP的研究甚少且观点不一。有些研究认为ApoE基因通过影响血浆维生素K和骨钙素水平调节骨代谢，故有些研究发现ApoE基因与骨密度有联系，认为ApoE4基因携带者骨量丢失多〔6〕，另有一些报道则认为ApoE与骨量丢失无关〔7，8〕。但到目前为止，对于OP的遗传易感性还不完全清楚。因此我们对ApoE基因进行了测定，发现当雌激素水平下降时ApoE表达减少;当雌激素水平升高时，ApoE表达随之升高，提示ApoE基因缺失可能导致OP，OP可能与遗传基因ApoE有关〔3〕，根据这一推测，对ApoEko小鼠股骨内OPG和RANKL无影响，从而提出雌激素的骨保护作用可能是通过ApoE基因实现的，但其确切机制仍需要进一步研究加以证实。

参考文献

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