慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠皮层HIF1α、HO1表达的变化

　　　　　　 作者：魏爱宣 徐忠信 郭洪亮 梅春丽 王晓明

【摘要】 目的 探讨低氧诱导因子(HIF)1α及其靶基因血红素加氧酶 (HO)1在慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠皮层中表达变化及意义。方法 大鼠双侧颈总动脉永久性阻断法(2VO) 建立慢性脑缺血模型，Morris水迷宫测定大鼠的学习记忆能力，免疫组化检测大鼠皮层HIF1α和HO1蛋白的表达。结果 Morris水迷宫表明缺血组大鼠逃避潜伏期和游泳路径均明显延长，免疫组化显示缺血组大鼠3、6、9 w皮层HIF1α、HO1表达明显高于假手术组(P<0.05)，HIF1α、HO1表达分别于3、6 w达高峰。结论 HIF1α及其靶基因HO1的高表达，可能作为保护性因素参与慢性脑缺血致认知功能障碍的过程。

【关键词】 慢性脑缺血;认知功能障碍;HIF1α;HO1

【Abstract】 Objective To investigate the expressive changes and significance of hypoxia inducible factor (HIF)1α and hemeoxygenase (HO)1 in the cortex of rats with cognitive impairment induced by chronic cerebral ischemia.Methods The chronic cerebral ischemia model was made by permanent bilateral occlusion of both common carotid arteries (CCA) occlusion (2VO).The rats were evaluated on learningmemory ability by Morris water maze test.The dynamic expressions of HIF1α and HO1 in cortex were measured by immunohistochemistry.Results The latency in each trial and swim distance of the 2VO were longer than those of the sham operation.The expressions of HIF1α and HO1 in the cortex of rats were higher than those of the sham operation group.The peaks of HIF1α and HO1 protein were respectively at the third and sixth week in the ischemia group.The difference between two groups was significant (P<0.05).Conclusions Both HIF1α and HO1 are highly expressed，may be involved in the course of cognitive impairment of chronic cerebral ischemia.

　　【Key words】 Chronic cerebral ischemia;Cognitive impairment;HIF1α;HO1

　　 慢性脑缺血致认知功能障碍研究已成为研究的热点〔1〕，其损伤机制尚不完全清楚。本实验建立大鼠慢性脑缺血认知功能障碍模型，对HIF1α及其相关靶基因HO1的表达进行了研究，并探讨其在慢性脑缺血致认知功能障碍中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 健康雄性Wistar大鼠，体重320～340 g，鼠龄2～ 3个月(吉林大学实验动物中心提供)，经Morris水迷宫实验筛选后，随即分为假手术组、缺血组。每组再根据缺血时间随机分为3、6、9 w组，每组8只。

　　1.2 动物模型的建立 参照Dela Torre等〔2〕采用的双侧颈总动脉永久性阻断法(2VO) 进行。10%水合氯醛300 mg/kg 腹腔注射麻醉，保证手术期间有自主呼吸，大鼠取颈前部正中切口，钝性分离双侧颈总动脉(CCA)，套以1号手术线双重结扎，逐层缝合。假手术组动物仅分离暴露双侧CCA而不结扎。

　　1.3 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫有圆形水池、自动摄像机及电脑分析系统组成。数据采集及图像分析均由图像自动监视和处理系统完成。

　　1.4 标本的采集 各模型组于行双侧颈总动脉结扎后的3、6、9 w时间点，开胸灌注固定，断头取脑，将脑组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中。脑组织经冲洗、脱水、透明、石蜡包埋、切片，免疫组织化学方法分析HIF1α和HO1蛋白的表达。

　　1.5 免疫组化染色及结果判定 免疫组化染色采用SP法，兔抗鼠HIF1α抗体和兔抗鼠HO1抗体均为武汉博士德公司产品。细胞质、胞核染成棕黄色为阳性细胞。应用彩色病理图像分析系统，每张切片选取3个200×镜下视野计数阳性细胞数，以单个标本为单位，取平均值。

　　1.6 统计学方法 数据以x±s表示，采用SPSS13.0软件进行组间方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 学习记忆能力检测 术后大鼠找到平台所用时间越长，表明在此期间行走距离越长，说明其学习记忆保持能力越差，提示学习记忆受损严重。缺血3、6、9 w时，与假手术组相比，缺血组大鼠学习记忆成绩均明显下降(P<0.05)。见表1。表1 各组大鼠不同缺血时间逃避潜伏期和游泳距离与假手术组比较:1)P<0.05，下表同

　　2.2 HIF1α和HO1在大鼠海马和大脑皮层的表达 见表2，图1。假手术组偶见HIF1α、HO1阳性细胞，缺血组各时间点表2 各组大鼠不同时间点皮层HIF1α及HO1免疫组化表达变化图1 缺血组大鼠皮层3 w时HIF1α和

　　6 w时HO1表达(免疫组化，×200)均可见HIF1α、HO1表达增高，HIF1α阳性蛋白表达主要为胞核染色呈棕黄色，HO1阳性蛋白表达主要为胞浆染色呈棕黄色，HIF1α以缺血3 w时最明显，HO1 6 w时最明显，并均高于假手术组，与假手术组比较差异显著(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　有研究表明在低灌注及低代谢状态下，大鼠的学习记忆功能可发生减退〔1〕。本研究通过Morris水迷宫实验检测2VO大鼠的学习记忆能力，证实了慢性脑缺血确实能够使大鼠出现明显的学习记忆障碍，并且随缺血时间的延长，学习记忆损害也呈进行性加重。

　　研究在慢性脑缺血致认知功能障碍模型基础上，采用免疫组化观察不同时间HIF1α和HO1蛋白表达，结果显示，缺血3、6、9 w均可见明显缺血神经元，缺血3 w时HIF1α阳性表达最明显，此后缓慢下降，与假手术组比较仍处于较高水平，同时有HO1的表达增加，HO1蛋白表达时间延迟于HIF1α表达，以缺血6 w时最明显，9 w时逐渐下降。HO1表达晚于HIF1α，表明HIF1α表达可能是脑缺血时首发的分子反应，进而促进HO1缺氧应激蛋白的基因表达，内源性保护系统被激活，发挥代偿作用。

　　HIF1是在缺氧诱导的细胞核抽取物中发现的一种DNA结合蛋白分子，由HIF 1α与HIF1β以异源二聚体形式存在。HIF 1α是氧依赖性降解，正常情况下难以检测到，缺氧状态下HIF 1α蛋白降解减少，呈指数倍增长〔3〕。HIF1α已被证实为缺血、缺氧性损伤中最重要的信号转导途径之一〔4〕，诱导其下游多种靶基因表达，参与缺血/缺氧后血管生成、血管重塑、能量代谢、血管舒缩反应、细胞凋亡与增殖、红细胞生成等代偿过程〔5，6〕，以保持机体氧稳态，具有重要的病理生理学意义。

　　在HIF1调节的靶基因中，HO1编码基因是最重要的靶基因之一。有研究发现HIF1诱导的HO1过表达可以抑制心肌缺血/再灌注引起的炎症反应及抗凋亡作用〔7〕。HO1可以催化血红素降解，生成胆绿素、一氧化碳(CO)和二价铁。胆绿素是机体内有效抗氧化剂，CO可扩张血管和抗血小板聚集，二价铁可诱导铁蛋白表达，后者也具有抗氧化应激的作用。

　　本研究表明HIF1α及其相关靶基因HO1在慢性脑缺血的过程中表达上调，可能作为保护性因素参与了慢性脑缺血致认知功能障碍的过程，促进了机体的代偿功能，提示通过调节HIF1α活性以促进有利的靶基因表达可能成为治疗慢性脑缺血致认知功能障碍一个有效途

参考文献

1 O′Brien JT.Vascular cognitive impairment〔J〕.Am J Geriatr Psychiatry，2006;14：724 33.

　　2 Dela Torre JC，Aliev G.Inhibition of vascular nitricoxide after rat chronic brain hypoperfusion：spatial memory and immunocytochemical changes〔J〕.Cerebral Blood Flow Metab，2005;25:66372.

　　3 Lee JW，Bae SH，Jeong JW，et al.Hypoxiainducible factor (HIFα)：its protein stability and biological functions〔J〕.Exp Mol Med，2004;36(1)：112.

　　4 Kasuno K，Takabuchi S，Fukuda K，et al.Nitricoxide induces hypoxiainducible factor 1 activation that is dependent on MAPK and phosphatidylinositol 3kinase signaling〔J〕.J Biol Chem，2004;279(4)：25508.

　　5 Liu LX，Lu H，Luo Y，et al.Stabilization of vascular endothelial growth factor mRNA by hypoxia inducible factor 1〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2002;291(4):90814.

　　6 Fan LF，Diao LM，Chen DJ，et al.Expression of HIF1 alpha and its relationship to apoptosis and proliferation in lung cancer〔J〕.Cancer，2002;21(3)：25471.

　　7 Vulapalli SR，Chen Z，Chua BH，et al.Cardioselective overexpression of HO1 prevents I/Rinduced cardiac dysfunction and apoptosis〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002;283(2)：H68894.