2型糖尿病对大鼠心肌缺血再灌注损伤救援激酶信号通路的影响

【摘要】 目的 探讨2型糖尿病(T2DM)对心肌缺血后适应(ischemic postconditioning，IPO )减轻心肌缺血再灌注损伤作用的影响及可能机制。方法 高脂饮食联合STZ诱导制成T2DM大鼠模型，将60只雄性Wistar大鼠随机分为正常大鼠缺血再灌注组(A组)、正常大鼠缺血后适应组(B组)、糖尿病大鼠后适应组(C组)。3组均采用离体大鼠心脏Langendorff灌流方法，全心停灌30 min，复灌60 min，制成心肌缺血再灌注模型。B、C组在再灌注开始前先给予再灌注10 s，全心停灌10 s，共6次循环的IPO。免疫组织化学染色及Western印迹法测定心肌磷酸化Akt，磷酸化糖原合成酶激酶(GSK3β)的表达。结果 正常离体大鼠心肌IPO干预后磷酸化Akt及GSK3β的表达增强;而对T2DM大鼠给予IPO处理后磷酸化Akt及GSK3β的表达无增强，去磷酸化GSK3β表达增强。结论 IPO对正常大鼠离体心脏缺血再灌注损伤有明确的保护作用，而对T2DM大鼠心肌缺血再灌注损伤无保护作用;其机制可能与糖尿病状态下影响再灌注损伤救援激酶信号通路，导致GSK3β活性(去磷酸化水平)增高有关。

【关键词】 缺血后适应;糖尿病;缺血再灌注损伤;再灌注损伤救援激酶信号通路

【Abstract】 Objective To elucidate the effects of ischemic postconditioning(IPO) on ischemia/reperfusion(I/R) cardiac and the role of reperfusion injury salvage kinase pathway in type 2 diabetic rats . Methods The type 2 diabetic rats were induced by the intravenous injection of streptozotocin and high caloric diet. Sixty Wistar rats were randomly devided into I/R in nomal rats(A)， IPO in normal rats(B)， IPO in diabetic rats(C) groups. Rats were given for Langendorff isolated heart perfusion with 30 min of globe ischemia and 60 min of reperfusion， then the models of group A were made. But the rat hearts of group B and C were subjected to 6 cycles of 10 min of globe ischemia and 10 min of reperfusion as IPO during the early minutes of reperfusion. Phosphorylation of akt and gsk3β were analyzed by Western blot and immunohistochemical staining. Results The phosphoakt and phosphogsk3β expressions were increased markedly in B group. But compared those in A group there was no difference in C group. The phosphoakt and phosphogsk3β expressions in C group were more less than those in B group. Conclusions IPO may significantly protect myocardium in isolated normal rat hearts . But in diabetic rats， the protection of IPO has no effect， the mechanism of this phenominon maybe related to gsk3β in the condition of diabetic.

　　【Key words】 Ischemic postconditioning; Diabetic ; Ischemic /reperfusion injury ; RISK pathway

　 糖尿病是冠心病主要危险因素，急性心肌梗死(AMI)合并糖尿病人群的死亡率也高于非糖尿病人群。2003年VintenJohansen实验室提出了应用心肌缺血后适应处理(ischemic postconditioning，IPO)可减轻心肌缺血再灌注损伤，其可能的机制是IPO激活再灌注损伤救援激酶(reperfusion injury salvage Kinase，RISK)通路〔1，4〕。但IPO对糖尿病心肌保护作用目前研究甚少，而且IPO对糖尿病心肌是否存在保护作用的研究结果尚不一致。本研究通过观察IPO在糖尿病状态下RISK通路中重要靶点糖原合成酶激酶(GSK3β)的变化，探讨2型糖尿病(T2DM)大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及可能的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 链脲佐菌素(STZ)、氯化三苯基四氮唑(TTC)购于美国Sigma公司;Akt、PAkt、GSK3β、PGSK3β抗体购于美国Cell Signaling 公司。

　　1.2 实验动物与分组 60只清洁级雄性Wistar大鼠，体重180～200 g，由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供。将大鼠随机分为正常大鼠缺血再灌注组(A组)、正常大鼠缺血后适应组(B组)、糖尿病大鼠后适应组(C组)，每组20只。

　　1.3 T2DM动物模型建立 给予成年雄性Wistar大鼠高脂饲料饲养1个月建立胰岛素抵抗模型，然后给予大鼠小剂量STZ(30 mg/kg)一次性腹腔注射，给药7 d后，检测血糖>16.7 mmol/L为T2DM大鼠模型。动物继续喂养4 w。

　　1.4 大鼠心脏离体灌注 给予大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定动物四肢，随后腹腔注射500 U肝素抗凝，迅速取出心脏浸于4℃ KrebsHenseleit缓冲液(缓冲液成分：118 mmol/L氯化钠，25 mmol/L碳酸氢钠，1.2 mmol/L磷酸二氢钾，4.7 mmol/L氯化钾，3.0 mmol/L氯化钙，1.2 mmol/L硫酸镁，11 mmol/L葡萄糖，0.5 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 7.4)，1 min内主动脉插管悬挂于Langendorff装置上，用改良KrebsHenseleit缓冲液行非循环式主动脉逆行灌流，灌流压65 mmHg，灌流液温度维持在37℃，pH 7.4，灌流液以95%氧气、5%二氧化碳混合气饱和。A组全心停灌缺血30 min，60 min 复灌再灌注期;B、C两组全心停灌缺血30 min后，再灌注开始前先给予再灌注10 s，全心停灌缺血10 s，共6次循环，然后继续给予再灌注至60 min。

　　1.5 免疫组化染色 采用SP法，以PBS代替一抗作为阴性对照染色。石蜡包埋组织切片常规脱蜡至水，以1% h3O2灭活内源性过氧化物酶，室温5～10 min，蒸馏水洗3次;枸橼酸盐缓冲液中微波修复抗原，冷却后，0.1 mol/L PBS洗1～2次;正常山羊血清封闭非特异性抗原，室温孵育20 min，甩去多余液体，不洗;分别滴加适当稀释的特异性一抗，4℃过夜;根据一抗的不同，滴加相应二抗(IgG/Biotin)，室温孵育40 min，PBS洗3次，5 min/次;滴加相应辣根过氧化物酶(SA/HRP)工作液，室温孵育20 min，PBS洗4次，5 min/次;二氨基联苯胺双氧水(DABh3O2)显色，室温5～30 min，蒸馏水洗涤;苏木素复染，中性树脂封片。

　　1.6 Western 印迹检测磷酸化Akt及 GSK3β 冰上剪取左心室组织称重，按每20 mg组织加入200 μl的比例加入含PMSF(终浓度为1 mmol/L)的RIPA 强裂解液(Cell Signaling)，内切式匀浆器16 000 r/min冰上匀浆40 s，间歇1 min，重复3次。匀浆液13 000 r/min 4℃ 离心20 min。考马斯亮蓝法测定上清蛋白浓度。SDSPAGE电泳的蛋白上样量为50 μg/孔，每组蛋白样品加入浓度为1×载样缓冲液，煮沸5 min，冰浴2 min，预染蛋白Marker 同上处理。SDSPAGE电泳，电压150 V时间4 h，蛋白经电转移4℃过夜至PVDF膜上。常规洗膜封闭，一抗、Tubulin 和辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。采用Cell Signaling生产的荧光标记的试剂盒，X光胶片压片显影定影检测PVDF膜上的蛋白表达。PVDF膜上的蛋白印迹区带，采用美国凝胶成像系统Worklaber软件分析，每个蛋白印迹区带的光密度值积分表示各组特定蛋白的表达量，以特定蛋白/Tubulin的光密度值积分比作为特定蛋白相对表达量，数值用R值表示，实验结果均重复3次。

　　1.7 统计学方法 数据资料以x±s表示，用SPSS10.0软件分析，组内比较用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 T2DM大鼠模型指标 正常大鼠进食、饮水量正常，情绪稳定，毛色白而有光泽。高脂饮食组给予2%STZ腹腔内注射后，饮水量较造模前明显增加，精神萎靡，毛色发黄，无光泽，尿量增加明显;给予2%STZ腹腔内注射第7天，糖尿病组血糖明显高于正常组，体重下降高于正常组，差别有统计学意义(P<0.05)。见表1。

　　2.2 免疫组化染色 B组磷酸化Akt、磷酸化GSK3β表达明显强于A组。C组磷酸化Akt、磷酸化GSK3β表达均明显弱于B组，但与A组比较无明显差别。见图1。表1 各组大鼠血糖以及体重比较与对照组比较：1)P<0.05

　　图1 各组免疫组化染色(×400)

　　2.3 Western 印迹检测 磷酸化GSK3β表达B组与A、C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、图3。

　　图2 各实验组蛋白质表达(1)Akt;(2)磷酸化Akt〔PAkt(Ser473)〕;(3)去磷酸化GSK3β(活性);(4)磷酸化的GSK3β〔(PGSK3β) PhosphoGSK3β(Ser9)〕;(5)Tubulin

　　3 讨 论

　　IPO是在缺血心肌再灌注开始时，对闭塞的冠状动脉给予短暂的、重复几次的再灌注缺血处理，随后完全开放闭塞的冠状动脉，与直接完全开放冠脉比较，其发生再灌注损伤的程度明显减小〔1〕;表现为心肌梗死面积减小，再灌注性心律失常减轻，心功能及血流动力学指标受损程度减小〔2〕。但在糖尿病状态下，其心肌保护作用明显减弱或消失〔3〕。目前IPO对糖尿病心肌缺血再灌注损伤保护作用减弱的机制研究尚不清楚，可能与糖尿病影响RISK通路中的蛋白激酶磷酸化有关〔4〕。近期很多研究均支持PI3KAkt-GSK3β信号通道在IPO心肌保护机制中起主导作用〔5〕。GSK3β是IPO下游关键中介物质，心肌IPO干预通过激活PI3KAkt途径使GSK3β磷酸化水平增高而失活，失活的GSK3β减轻了其对心肌细胞内线粒体通透性转换孔(mPTP)的过度开放作用，避免心肌的再灌注损伤〔6，7〕。糖尿病可使GSK3β活性增强，影响RISK信号传导通路磷酸化水平，可能导致IPO对糖尿病缺血心肌再灌注损伤的保护作用减弱或消失〔8〕。

　　本研究结果显示正常大鼠B组磷酸化Akt、磷酸化GSK3β表达明显强于A组，而C组磷酸化Akt、磷酸化GSK3β表达均明显弱于B组，但与A组比较无明显差别。因此考虑IPO干预对正常大鼠离体心脏缺血再灌注损伤有明确的保护作用，而对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤无保护作用。IPO对于糖尿病大鼠无心肌保护作用机制可能是由于糖尿病状态下Akt激活不足或GSK3β活性(去磷酸化水平)增高所导致。Derek等〔3〕在研究中采用GK大鼠(2 型糖尿病大鼠)离体心脏灌流，发现后适应组与对照缺血再灌注组相比心肌梗死面积无显著差异〔(41.0±3.2)% vs(46.6 ±5.2)%〕，而且两组磷酸化Akt也无明显差异。正常生理状态下，GSK3β是参与糖原代谢的关键酶，能使糖原合成酶磷酸化，降低糖原合成，使血糖升高。胰岛素抵抗和T2DM状态下PI3KAkt通道Akt磷酸化程度降低〔9〕。由于糖尿病引起Akt磷酸化程度下降，导致下游GSK3β磷酸化水平下降，活性增强，进而影响了IPO对糖尿病心肌的保护作用。

参考文献

1 Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003;285(2):57988.

　　2 Pinheiro BB，Fiorelli AI，Gomes OM. Effects of ischemic postconditioning on left ventricular function of isolated rat hearts〔J〕.Rev Bras Cir Cardiovasc，2009;24(1):317.

　　3 Hausenloy DJ，Tsang A，Yellon DM.Postconditioning does not protect the diabetic heart 〔J〕.J Mol Cellular Cardiol，2006;40：9201015.

　　4 Hausenloy DJ，Tsang A，Yellon DM.The reperfusion injury salvage kinase pathway:a common target for both ischemic preconditioning and postconditioning〔J〕.Trends Cardiovasc Med，2005;15(1)：6975.

　　5 Hausenloy DJ，Yellon DM. Survival kinases in ischemic preconditioning and postconditioning〔J〕.Cardiovasc Res，2006;70(2)：24053.

　　6 Zorov DM，Juhaszova M，Yaniv Y，et al.Regulation and pharmacology of the mitochondrial permeability transition pore〔J〕.Cardiovasc Res，2009;83(2):21325.

　　7 Gomez L，Paillard M，Thibault H，et al.Inhibition of GSK3β by postconditioning is required to prevent opening of the mitochondrial permeability transition pore during reperfusion〔J〕.Circulation，2008;117(21):27618.

　　8 Henriksen EJ，Dokken BB.Role of glycogen synthase kinase3 in insulin resistance and type 2 diabetes〔J〕.Curr Drug Targets，2006;7(11):143541.

　　9 Draznin B，Miles P，Kruszynska Y，et al.Effects of insulin on prenylation as a mechanism of potentially detrimental influence of hyperinsulinemia〔J〕.Endocrinology，2000;141(4):13106.