蝇蛆壳聚糖对高脂血症大鼠的降脂保肝作用

　　　　　　 作者：覃容贵 吴建伟 国果 付萍

【摘要】 目的 研究不同脱乙酰度的蝇蛆壳聚糖对实验性高脂血症大鼠的降脂保肝作用。方法 采用酸碱化学法制备不同脱乙酰度的蝇蛆壳聚糖，并用红外扫描鉴定其结构。取大鼠给高脂饲料造模的同时连续分别给予不同脱乙酰度的蝇蛆壳聚糖8 w，测定大鼠血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)含量，测定肝脏指数和肝组织中TC含量，并对各组大鼠肝脏进行病理观察。结果 各脱乙酰度组蝇蛆壳聚糖均能显著降低血清TC、TG、LDLC含量(P<0.01)，显著升高HDLC含量(P<0.01)，降低大鼠的肝脏系数及肝组织TC含量(P<0.01)，并能减轻肝细胞脂变程度。结论 不同脱乙酰度的蝇蛆壳聚糖能调节实验性高脂血症大鼠血脂代谢，抑制肝脏脂肪沉积，有良好的降脂保肝作用，其作用与脱乙酰程度呈正相关。

【关键词】 蝇蛆壳聚糖;脱乙酰度;实验性高脂血症;降脂保肝

　　 Research of housefly maggot chitosan on lowering lipid and hepatoprotective effectQIN RongGui， WU JianWei， GUO Guo， et al.Department of Pharmacognosy， Pharmaceutical College， Guiyang Medical University， Guiyang 550004， Guizhou， China【Abstract】 Objective To study effects of degree of deacetylation of housefly maggot chitosan (HMC) on lowering lipid and hepatoprotective action.Methods The chemical method was used to prepare deacetylated HMC of 72.3%， 80.5%， 96.1% and infrared scanning was used to identify its structure. The rats were fed with high cholesterol diet and were administrated different deacetylation HMC continuously for 8 weeks at the same time， then the blood lipid were measured. The liver weight (LW)， liver index (LI) and cholesterol content were also tested. Pathological changes of liver were observed. Results The scrum total cholesterol (TC)， triglyceride (TG)， low density lipid cholesterol (LDLC) in the different deacetylation group were significantly lower than those in hypercholesterolemia control group(P<0.01)， the content of high density lipid cholesterol (HDLC) was significantly higher in different deacetylation group than that of hypercholesterolemia control group(P<0.01). The LI levels and TC content in liver of HMC groups were significantly lower than those of model group(P<0.01). Pathological examination of the liver showed milder hepatic pathology of fatty degeneration in the HMC groups than in the model group. Conclusions HMC can modulate the blood lipid levels， ameliorate the hepatic pathology of fatty degeneration and lowers LI in hyperlipidemic rats， which has positive relation with the degree of deacetylation.

　　【Key words】 Housefly maggot chitosan; Deacetyiation; Hypercholesterolemia; Lowering lipid and hepatoprotective effect

　　 随着我国经济的发展，食物结构不断改变，国内高脂血症患者日益增多，因此寻找疗效确切、毒副作用小的降血脂药已成为各国医药界关注的重要课题。近年研究表明，壳聚糖具有降血压、降血脂、降血糖、增强免疫力、抗肿瘤及延缓衰老等生物学作用〔1〕，作为保健食品或降脂药物有着广泛的前景。壳聚糖脱乙酰度的高低，直接关系到它在稀酸中的溶解能力、黏度、离子交换能力、絮凝性能和与氨基有关的化学反应能力以及多方面的应用〔2〕。壳聚糖脱乙酰度对高脂血症模型动物的影响未见报道。本文采用贵州琨恩生物技术公司利用酿造茅台酒的酒糟饲养的蝇蛆制备了3种不同脱乙酰度的蝇蛆壳聚糖，并对其降脂保肝作用进行研究，以期为壳聚糖能更好地应用于保健食品领域提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 蝇蛆甲壳素(琨恩生物技术有限公司提供);氢氧化钠分析纯(上海试四赫维化工有限公司);盐酸分析纯(遵义师范学院化工试剂厂);胆固醇(TC)分析纯〔中国医药(集团)上海化学试剂公司〕;丙硫氧嘧啶(海集成药厂);胆盐分析纯〔中国医药(集团)上海化学试剂公司〕;TC试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)试剂盒(北京中生北控生物科技股份有限公司);Vertex70红外扫描仪(德国Bruker公司);OlympusAU400全自动生化分析仪(日本Olympus公司)。

　　1.2 实验动物 SD大鼠，雄性，50只，体重180～205 g，贵阳医学院实验动物中心提供。基础饲料由贵阳医学院实验动物中心提供。高脂饲料配制：用2%胆固醇，10%猪油，0.2%丙硫氧嘧啶，1%蛋黄粉，0.5%胆盐及86.3%基础饲料配制而成。

　　1.3 实验材料的制备及鉴定

　　1.3.1 壳聚糖的制备 分别称取3份蝇蛆甲壳素5.0 g进行脱乙酰反应，NaOH浓度为60%，液固比为20 ml/g，100℃下分别反应4、6、8 h。反应至预定时间后，停止反应，用热蒸馏水反复冲洗至中性，烘干至恒重，可得到不同脱乙酰度的壳聚糖。

　　1.3.2 壳聚糖脱乙酰度的测定参照文献〔3〕

　　1.3.3 不同脱乙酰度壳聚糖的红外鉴定 将壳聚糖干燥至恒重，与溴化钾(KBr)混合研磨、压片，在400～4 000 cm-1测红外光谱图。

　　1.4 动物实验方法 用基础饲料适应性喂养大鼠5 d后，随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组：以基础饲料喂养;高脂模型组：以高脂饲料喂养;蝇蛆壳聚糖72.3%、80.5%、96.1%脱乙酰度组：给高脂饲料的同时分别灌胃给予不同脱乙酰度蝇蛆壳聚糖600 mg/kg，连续给药8 w。正常对照组和高脂模型组分别给等量蒸馏水。

　　1.5 检测指标 于末次给药后，大鼠禁食12 h，股动脉放血处死。取血并分离血清测定TC、TG、HDLC、LDLC含量。另取出肝脏并称肝重(LW)，计算肝脏系数(LI);在肝右叶离边缘1 cm处，横切一块肝组织，用中性甲醛固定，常规脱水，石蜡切片，HE染色，光镜下观察肝脏病理形态学改变。于剩余肝脏中取组织，在蒸馏水中漂洗数次，滤纸吸干，称重1 g，放入组织匀浆器，加3 ml生理盐水匀浆10 min，将浆液放入冰箱(-20℃)3～4 h，进行肝脏脂质测定。

　　1.6 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS13.0统计软件进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 产品脱乙酰度的测定 碱浓度60%，100℃下分别反应4、6、8 h，产物脱乙酰度分别为72.3%、80.5%、96.1%。

　　2.2 不同脱乙酰度壳聚糖红外扫描 壳聚糖在1 595 cm-1(Nh3)，1 648 cm-1(酰胺谱带1)和1 424 cm-1(酰胺谱带2)的特征吸收峰，在1 480 cm-1(COCH3中C=O)处吸收峰强度较弱，3个相似的吸收峰曲线显示不同脱乙酰度壳聚糖主链中的结构是相同的〔3〕。但高度脱乙酰壳聚糖在3 430 cm-1(OH和Nh3)和1 594 cm-1(Nh3)处的吸收明显强于低度脱乙酰壳聚糖，这说明高度脱乙酰壳聚糖游离的Nh3增多。

　　2.3 不同脱乙酰度蝇蛆壳聚糖对血脂代谢的影响 给高脂饲料8 w后，高脂模型组大鼠血清TC、TG、LDLC含量显著升高，HDLC含量显著降低，表明高脂模型造模成功(P<0.01)。结果表明，壳聚糖可以明显抑制TC、TG及LDLC含量的升高(P<0.01)，抑制HDLC含量的降低(P<0.01)，对大鼠实验性高脂血症有预防作用。不同脱乙酰度组间大鼠TC、TG、LDLC及HDLC含量差别均有统计学意义(P<0.01)，且TC、TG、LDLC含量的降低，HDLC含量的升高均与壳聚糖脱乙酰程度呈正相关。见表1。表1 蝇蛆壳聚糖对血脂代谢的影响与正常对照组比较:1)P<0.01;与高脂模型组比较：2)P<0.01

　　2.4 蝇蛆壳聚糖对高脂模型大鼠肝脏的影响

　　2.4.1 蝇蛆壳聚糖对高脂模型大鼠LI及肝脏TC水平的影响 给高脂饲料4 w，高脂模型组大鼠LI显著升高，肝脏TC含量显著升高，与正常对照组相比，差别有显著性意义(P<0.01)，表明高脂模型造模成功。给予蝇蛆壳聚糖，各脱乙酰组LW、LI均降低，其中中、高脱乙酰度组与高脂模型组比较有显著性差异(P<0.01)。各脱乙酰组肝脏TC含量均降低，与高脂模型组比较有显著性差异(P<0.01)。见表2。表2 蝇蛆壳聚糖对高脂模型大鼠LI及肝脏TC水平的影响与正常对照组比较:1)P<0.01;与模型组比较：2)P<0.01

　　2.4.2 蝇蛆壳聚糖对高脂模型大鼠脂肪肝变性程度的抑制作用 血脂代谢的紊乱导致肝脏脂肪的聚积是诱发脂肪肝的因素之一。在实验中我们观察到高脂模型组大鼠脂肪肝、水肿的形成显著高于正常对照组。而药物干预治疗可减轻脂肪肝的程度。病理结果显示正常对照组肝小叶结构清楚完整，肝索排列规则，肝细胞形态规则，排列正常。高脂模型组肝小叶结构模糊不清，部分肝细胞索结构消失，肝细胞排列紊乱，肝细胞胞浆内出现大小不一的脂肪空泡，肝细胞肿大明显。经药物治疗后脂肪肝的变性程度减轻，肝小叶结构尚存，肝组织结构大致正常，部分肝细胞索排列紊乱，肝细胞轻度水肿。高脱乙酰度组肝组织结构与正常对照组相似，其余各脱乙酰度组光镜下所见大致介于正常对照组和高脂模型组之间。见图1。图1 大鼠肝组织切片图

　　3 讨 论

　　3.1 蝇蛆壳聚糖的调血脂作用 甲壳素不溶于水及有机溶剂，很难被人体利用，只有其脱乙酰基所得产物壳聚糖才能被人体吸收利用。因此，脱乙酰度是壳聚糖重要的质量指标。分子量的高低、脱乙酰度的不同，对壳聚糖的物理机械性能、生理活性有直接影响〔2〕。有研究报道表明壳聚糖对TC的吸附性能与其脱乙酰度有密切关系。吴雁等的体外吸附实验研究表明脱乙酰度为95%壳聚糖结合胆酸盐的能力明显高于脱乙酰度为86%的壳聚糖。揭示了壳聚糖对胆酸盐结合能力主要归于壳聚糖的氨基阳离子作用〔4，5〕。叶立新等将不同分子量、不同脱乙酰度和不同粒径的壳聚糖，分别加入到含高TC的血清中，结果表明壳聚糖用作体外血清TC吸附剂具有优良血液相容性和吸附性，其吸附行为与分子量、脱乙酰度和粒径有关。脱乙酰度越高，吸附能力越强〔6〕。

　　本研究用蝇蛆壳聚糖喂养实验性高脂血症大鼠，结果显示各脱乙酰度蝇蛆壳聚糖能够显著降低血清中TC和TG的水平，增高血清HDLC水平，降低LDLC水平，具有显著的降血脂作用。其降血脂作用除了与壳聚糖的摄取剂量有关外，还与壳聚糖的脱乙酰度有关，在相同剂量情况下，脱乙酰度越高，其降低TC、TG、LDLC含量及升高HDLC含量的作用越强。实验结果与以上文献报道的壳聚糖体外吸附脂肪作用相符。这可能是因为壳聚糖组成中的葡聚糖胺链带有游离Nh3，脱乙酰度越高，壳聚糖分子中游离Nh3越多，易于与胃酸作用或与脂肪混合形成复合物，吸附脂肪、胆汁和TC，阻止脂解作用，减少了脂肪吸收的作用越强，从而显著降低血清中血脂的水平。

　　3.2 蝇蛆壳聚糖的保肝作用 临床研究表明，高脂血症与脂肪肝形成密切相关，高脂血症患者脂肪肝患病率显著高于血脂正常者〔7〕。高脂血症引发的脂质代谢障碍可致大量脂肪积聚于肝脏，当超过肝脏的代谢能力时可引起肝脏脂肪变性，这是脂肪肝形成的“第一次打击”;若为活性氧/脂质过氧化提供足够的反应底物，再在内毒素、细胞因子等作用下，容易触发脂质过氧化反应，导致肝脏的炎症性坏死甚至纤维化，此为“第二次打击”〔8，9〕。实验结果表明，从LW及肝脏TC结果来看，高脂血症模型大鼠LW、LI及TC含量显著升高;从肝脏病理形态学结果来看，高脂血症模型大鼠肝细胞脂肪变性及水样变性，肝细胞明显肿胀，汇管区炎症细胞浸润，表明高脂饮食对大鼠肝脏细胞的脂肪变作用显著。蝇蛆壳聚糖干预8 w能显著降低高脂血症大鼠的LW、LI及TC含量，有效保护肝细胞，抑制肝细胞水肿及脂肪变性的发生，具有非常显著性差异。中、高脱乙酰度蝇蛆壳聚糖能显著降低LW、LI(P<0.01)，低、中、高脱乙酰度蝇蛆壳聚糖能显著降低肝脏TC含量(P<0.01);高脱乙酰度蝇蛆壳聚糖肝脏脂肪变性程度明显减轻，肝细胞水肿减少，使肝细胞几乎保持正常状态。因此，我们可以推论，蝇蛆壳聚糖可能通过降低血脂来减轻甚至消除脂肪肝形成，同时降低肝脂质，对高脂饮食引起的大鼠肝脏细胞损伤具有修复作用，能减轻高脂血症大鼠肝脏的脂肪变性及炎性坏死现象。提示蝇蛆壳聚糖可能通过调节血脂水平，降低脂肪肝和动脉硬化病变程度，从而达到预防心脑血管疾病的目的。本实验观察了给予蝇蛆壳聚糖灌胃8 w后的实验结果，长期给予该产品是否更有利于阻止高脂血症大鼠肝脏脂肪变性的进展，逆转肝脏损害有待进一步实验证实。

　　实验所用蝇蛆壳聚糖由蝇蛆甲壳素制备而得，甲壳素是蝇蛆体内宝贵的天然生物资源，蛆皮中的甲壳素含量高于虾蟹壳，而碳酸盐和重金属含量低、色素少，质量远优于虾蟹壳中的甲壳素;蝇蛆壳聚糖是含氨基的天然高分子多糖，由于其固有的生物相容性、可生物降解性及无毒性，不产生变态反应，对机体有非常温和的免疫刺激影响，又便于制备，在作为调血脂药物方面具有优势，有良好的应用前景〔10〕。本文采用酸碱法制备蝇蛆壳聚糖，通过控制不同的反应时间得到不同脱乙酰度的壳聚糖。但本法制备壳聚糖存在消耗试剂量大、耗能高、产物脱乙酰度不太稳定等缺点，下一步拟在精简工艺，降低耗料上进一步研究。

参考文献

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　　3 聂 莉，吴晓芳，伊 萍，等.壳聚糖中脱乙酰度测定方法的探讨〔J〕.中国卫生检验杂志，2005;15(3)：3289.

　　4 吴 雁，王亦农，马建标.水溶性壳聚糖降血脂作用的化学机理(Ⅰ)水溶性壳聚糖及其衍生物对胆酸盐的结合能力研究〔J〕.高等学校化学学报，2004;25(4)：75761.

　　5 吴 雁，王亦农，马建标.水溶性壳聚糖降血脂作用的化学机理(Ⅱ)水溶性壳聚糖及其氨化衍生物对硬脂酸钠、十二烷基硫酸钠结合能力研究〔J〕.离子交换与吸附，2003;19(4)：3703.

　　6 叶立新，郑铁生，吴志勇.壳聚糖体外吸附血清胆固醇的作用及其影响因素〔J〕.江苏大学学报(医学版)，2005;15(6)：498500.

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　　10 胡迎清，汪晓莺，季玉红.壳聚糖、月见草、舒降之降血脂作用及机制研究〔J〕.中国心血管病研究杂志，2005;3(11)：847.