忧虑康液对肾阴虚抑郁模型大鼠血浆促肾上腺皮质激素、皮质醇及下丘脑形态学的影响

　　　　 作者：陈晓阳 李晟 邹志 秦莉花 丁志高 蒋孟良

【摘要】 目的 探讨忧虑康液对抑郁肾阴虚模型大鼠血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(CORT)含量及下丘脑细胞形态学的影响。方法 采用慢性不可预见性应激并灌胃甲状腺素加孤养法复制抑郁肾阴虚大鼠模型，以放射免疫方法测定血浆ACTH、CORT水平，HE染色光镜下观察各组大鼠下丘脑形态学变化。结果 与正常组比较，抑郁肾阴虚模型大鼠血浆ACTH、CORT含量显著上升(P<0.01)，下丘脑形态学表现室旁核界限不清、神经元胞体增大、部分出现空泡样变性。与模型组比较，忧虑康液各剂量组及氟西汀组下调血浆ACTH、CORT浓度具有统计学意义(P<0.01，P<0.05);忧滤康液中、高剂量组可恢复抑郁大鼠下丘脑神经元数目，改善细胞形态，减少细胞空泡样变化，增大核/质比例。结论 慢性轻度不可预见性应激并灌胃甲状腺素加孤养法，可使大鼠神经内分泌发生异常改变，引起抑郁状态;忧虑康液可能通过降低血浆ACTH、CORT浓度及保护下丘脑结构而拮抗抑郁。

【关键词】 慢性应激;形态学;忧虑康液;大鼠;实验研究

　　【Abstract】 Objective To approach the effect of Youlükang on the ACTH，CORT density in the plasma and hypothalamus cell morphology of modeling rats following deficiency of kidneyYIN depressed.Methods Model of deficiency of kidneyYIN depressed rats were by using chronic unpredictable stress and oral thyroxine plus Custody Act alone method， radioimmunity determine was used to detected ACTH，CORT levels in the plasma， HE dyeing was given to observe every group rats′ hypothalamus morphologic changes.Results The ACTH，CORT density in the plasma of the deficiency of kidneyYIN depressed modeling rats were increased significantly， compared with normal group (P<0.01). The morphology of hypothalamus exhibited paraventricular with unclear bourn and neurons increased，even part of some place emerging vacuolesly degeneration.Compare with model group，You lü kang each dose group and the fluoxetine group reduced plasma ACTH，CORT concentration were statistically significant (P<0.01，P<0.05);and the number of neurons in the hypothalamus some recovery，neurons vacuoles degeneration could be improved.Conclusions Chronic light unpredictability and stress hormone administered alone raised increasing act can make in rat neuroendocrine abnormalities and cause depression;Youlükang shows a certain degree of antagonism by decreasing ACTH，CORT and protecting hypothalamus structure.

　　【Key words】 Chronic stress;Morphology;Youlükang;Rat;Experimental study

　　 忧虑康液系中药复方，具有滋阴填髓、解郁除烦之功效，该方治疗肾阴虚抑郁症有独特之处。药效学实验研究〔1，2〕显示该方能影响肾阴虚抑郁模型大鼠行为改变，提升单胺类神经递质5羟色胺(5HT)水平，调整血浆cAMP/cGMP平衡，明显改善其抑郁和肾阴虚状态。现将其对神经内分泌激素及下丘脑形态学作用的实验方法及结果，介绍如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 健康SD大鼠，雌雄各半，体质量(170～190)g，由湖南省长沙市开福区东创科技服务部提供，合格证号:SYXK(湘)20060001。

　　1.2 药物 忧虑康复方之饮片购于湖南中医药大学附属第一医院药剂科。第一次8倍体积饮用水冷浸30 min，再提取40 min，纱布过滤，第二次4倍量水提取30 min，过滤，合并2次滤液，减压浓缩成相应浓度(浸膏)，4℃保存备用。六味地黄丸(湖南省长沙九芝堂股份有限公司生产，产品批号：20050219;盐酸氟西汀胶囊(优克)(常州华生制药有限公司，产品批号：80706001);甲状腺素片(济南维尔康生化制药有限公司，产品批号：0505505)。

　　1.3 试剂与仪器 促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(CORT)放免分析试剂盒，北京市福瑞生物工程公司提供，批号：061120。放射免疫计数器(中国科学技术大学科技实业有限公司);电子天平(湘仪天平仪器有限公司);低温大容量高速离心机(中国科学技术大学科技实业有限公司);恒温烘箱;光学显微镜等。敞箱(自制)：由不透明材料制成，底面为100 cm×100 cm的正方形，被等分为25个等边方格，高50 cm。

　　1.4 实验方法

　　1.4.1 动物分组 将SD大鼠适应环境后，进行敞箱试验和液体消耗试验。根据敞箱试验和液体消耗试验结果，将筛选出的56只大鼠，按体质量随机区组分为7组：正常对照(正常) 组、模型对照(模型) 组、盐酸氟西汀(氟西汀)组、六味地黄丸(地黄丸) 组、忧虑康低剂量 (低剂量) 组、忧虑康中剂量(中剂量) 组、忧虑康高剂量(高剂量) 组。每组8只。整个实验过程中动物自由摄食和饮水(禁食禁水应激除外)，室温(22±3)℃(热、冷应激除外)，自然昼夜节律光照，相对湿度60%～70%，背景噪音(40±10) db。

　　1.4.2 造模及给药 除正常组外，其余各组均连续接受各种不同的应激及灌胃甲状腺素并孤养，以制备肾阴虚型抑郁症病证复合模型〔1〕。采取单笼饲养，并按以下程序从实验第1天起给予应激刺激，即昼夜颠倒，禁食禁水，潮湿垫料、鼠笼倾斜，40℃高温环境，夹尾，4℃冰水游泳，陌生异常物品，电击足底，共8种应激因子，随机安排每日1种，连续21 d;并每日灌胃甲状腺素2.5 mg·kg-1·d-1。造模同时氟西汀组给予盐酸氟西汀3.6 mg/kg，地黄丸组给予六味地黄1.6 g(生药)/kg，忧虑康低、中、高剂量分别给予忧虑康液7.2、14.4及28.8 g(生药)/kg，各组治疗药物灌胃容量为10 ml/kg;正常组与模型组均灌胃等容量蒸馏水，给药1次/d。

　　1.4.3 观察模型动物一般状态及体重 实验过程中观察大鼠外表、性情、活动情况、饮水量、大便情况，每周测1次体重。

　　1.4.4 液体消耗试验、敞箱试验 同期研究已有具体操作方法〔1〕。

　　1.4.5 ACTH、CORT测定 实验第22天，所有动物断头采血，取血1～2 ml进行检测，测定方法均严格按照ACTH、CORT试剂盒说明书。

　　1.4.6 脑组织形态学观察 大鼠处死后，取脑组织并切块，固定48 h，石蜡包埋，冠状切片，各级浓度脱水，HE染色，光镜下观察脑组织形态学。

　　1.5 统计学方法 运用SPSS11.5软件。所有数据均先经方差齐性检验，方差齐用F检验，方差不齐用秩和检验。实验数据以x±s表示。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠一般状态比较 正常组在整个实验过程中24 h饮水量变化不大;与正常组比较，实验第7天，各造模大鼠24 h饮水量均有下降趋势，表明大鼠出现抑郁而不愿多饮水。实验第14天，模型组饮水量陡增，表明在抑郁基础上又出现了阴虚状况;用药各组饮水量有上升，但与模型组比较，六味地黄丸组和忧虑康中、高剂量组差异具显著性。直至实验第21天，模型组饮水量仍然持续升高不降;中药各治疗组饮水量基本恢复正常并保持平稳。

　　与正常组比较，各造模大鼠出现活动减少但捉拿时易激怒、毛无光泽、大便干燥等表现，与前期实验中肾阴虚抑郁模型反映出的现象相一致。实验第7天，各造模大鼠体重增长均较缓慢;实验第14天，与模型组比较，各用药大鼠攻击性明显减轻、粪便变软，体重增长较快;实验第21天，各用药大鼠体重增长均具有显著性意义(P<0.05)。

　　2.2 行为学指标的比较 在敞箱试验中，与正常组比较，实验第7天，各造模组水平得分、垂直得分、清洁次数指标值均下降，中央格停留时间延长;实验第21天，模型组各项指标均显著改变(P<0.01)。与模型组比较，实验第21天，氟西汀组各项指标值差异显著(P<0.05)，忧虑康高剂量组水平得分、中剂量组清洁次数增加以及低、中、高剂量组中央格停留时间显著减少(P<0.01)。

　　在糖试验中，实验第7天，各组糖水消耗以及糖水偏爱均低于正常组(P<0.05，P<0.01)。实验第21天，与模型组比较，氟西汀组糖水消耗、糖水偏爱升高显著(P<0.01)，表明氟西汀改善快感缺失效果较好;忧虑康3个剂量组效果与之接近，并随给药时间延长而稳定，见表1。表1 各组大鼠第7天、第21天敞箱、糖水试验结果比正常组比较：1)P<0.01，2)P<0.05;与模型组比较：3)P<0.01，4)P<0.05;下表同

　　2.3 忧虑康液对模型大鼠血浆ACTH、CORT浓度的影响 与正常组比较，模型组血浆ACTH、CORT含量增高显著(P<0.01);各用药组均可显著降低血浆CORT、ACTH含量(P<0.01)，尤以氟西汀组和滋肾益脑方各剂量组明显。见表2。

　　2.4 忧虑康液对模型大鼠下丘脑形态学的影响 正常组细胞大小一致，形态规则，界限清楚，胞浆较少，核/质比例大，与正常组比较，模型组下丘脑室旁核边界不清，神经元数目减少，细胞大小形态不一，部分胞体明显增大，细胞呈圆、亮的特性，细胞核浓染，胞浆增多，染色变浅，甚至有空泡样变化。氟西汀组和忧虑康中、高剂量组均基本恢复抑郁大鼠下丘脑神经元数目，改善细胞形态，减少细胞空泡样变化，增大核/质比例，低剂量组细胞数目较模型组的增加，细胞形态无明显变化;六味地黄丸组与模型组相比变化不明显，见图1。表2 各组大鼠血浆ACTH、CORT结果比较

　　3 讨 论

　　抑郁症是一种常见的情感障碍性精神疾病，抑郁症患者有很高的自杀或自残倾向。在未来10年内伴随着抑郁的流行有增长趋势，其严重危害性迫切要求我们加紧对抑郁的认识和治疗。目前，神经内分泌研究成了除单胺类神经递质外又一个研究的焦点。

　　下丘脑垂体肾上腺轴(HPA)是机体感知内稳态失衡威胁时的反应部位，该功能结构是一个经典的神经内分泌环。受到应激刺激时，脑的内分泌功能发生改变，主要表现为促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)分泌增多〔3，4〕，过多的CRH可进一步影响ACTH、糖皮质激素(GC)的分泌，从而使整个HPA轴功能表现为亢进。沈渔邨认为抑郁症发病与神经递质失调、大脑结构和功能异常、内分泌功能紊乱等密切相关〔5〕。Duval等〔6〕研究认为，抑郁症患者HPA处于异常激活状态，CORT分泌亢进;CORT水平升高可引起糖、盐皮质激素受体表达异常，诱导神经元凋亡，破坏海马的结构和功能，也可诱发5HT、NE神经元功能障碍，引起中枢单胺递质紊乱，最终可引发或加重抑郁症。动物研究证实，应激、尤其是慢性应激能抑制海马区的神经元再生和可塑性，而抗抑郁药物则可以有效地回复这一改变〔7〕。下丘脑室旁核是CRH的主要分泌部位，故下丘脑直接控制HPA 轴活动。因此研究药物对抑郁症神经内分泌的影响，更应观察脑形态学变化。

　　敞箱试验得分、糖水消耗量等是经典的反应动物抑郁行为学指标，也是最常用的观察方法。本研究结果显示，与正常组比较，模型组大鼠出现饮水量持续升高不降、捉拿时易激怒、毛无光泽、大便干燥、体重增长缓慢等阴虚症状，敞箱试验、液体消耗试验的各项指标差异均具有显著性，结合检测其血浆ACTH和CORT浓度明显升高及脑组织形态学改变等说明模型复制成功。

　　肾虚是一种综合的功能态，是多靶点、多环节的功能紊乱;肾虚证有其功能网络和调控中心，与神经内分泌网络关系密切;故对肾虚证的研究不能一味追求单一的特异性指标〔8〕，应当要综合起来分析。忧虑康液是笔者长期用于治疗抑郁症的经验方，方中熟地黄、何首乌、石斛滋阴益精填髓，当归、丹参合用补血活血，郁金、丹参合用凉血安神。现代药理研究证明熟地、郁金、石斛、丹参，或提高抗氧化酶活力以减少过氧化物，或降血糖、抗衰老、增强免疫力;熟地多糖能抑制HPA轴的功能亢进，恢复HPA轴机能平衡，熟地多糖、何首乌水煎液可改善痴呆小鼠的学习记忆障碍;温郁金提取液抑制血小板聚集，丹参活性成分扩张血管、改善微循环而对多种物质引起的肝肾功能损伤有保护作用。本实验从神经内分泌系统相互交织作用的角度探讨忧虑康液滋肾抗抑郁的作用机制。结果显示，忧虑康液降低外周血ACTH、CORT水平，逆转抑郁大鼠行为异常，部分恢复下丘脑神经元的数目、保护细胞结构完整性等作用显著，提示调整神经内分泌激素平衡、拮抗HPA轴的激活状态、保护脑神经元，是忧虑康液滋肾益脑综合抗抑郁的又一作用机制。本研究为忧虑康液治疗肾阴虚抑郁症提供了可靠的理论依据及实验依据，也为进一步阐明其治疗肾阴虚抑郁症的机制奠定了良好基础。

参考文献

　1 史 冰，陈晓阳，李 晟，等.忧虑康药对动物抑郁行为和血浆cAMP、cGMP的影响及毒性试验研究〔J〕.中华现代中医学杂志，2007;3(4):28993.

　　2 陈晓阳，陈 容，李 晟，等.肾阴虚抑郁症大鼠模型的建立及评价〔J〕.湖南中医药大学学报，2007;27(5):2831.

　　3 Coplan JD，Andrews MW，Rosenblum LAF，et al.Persistent elevations of cerebrospinal fluid concentrations of corticotropinreleasing factor in adult nonhuman primates exposed to earlylife stressors：implications for the pathophysiology of mood and anxiety disorders〔J〕.Proc Natl Acad Sci，1996;93(4)：161923.

　　4 GIowa JR，Gold PW.Corticotropin releasing hormone produces profound anorexigenic effects in the rhesus monkey〔J〕.Neuropeptides，1991;18(1)：5561.

　　5 沈渔邨编.精神病学〔M〕.第4版.北京：人民卫生出版社，2002：42834.

　　6 Duval F，Mokrani MC，MonrealOrtiz JA.Cortisol hypersecretion in unipolar major depression with melancholic and psychotic features：dopaminergic，noradrenergic and thyroid correlates〔J〕.Psychoneuroendocrinology，2006;31(7):87688.

　　7 Campbell S，Macqueen G.The role of the hippocampus in the pathophysiology of major depression〔J〕.J Psychiatry Neurosci，2004;29(6)：41726.

　　8 潘小平，蔡光先，刘柏炎.肾虚客观化研究进展〔J〕.湖南中医药大学学报，2008;28(1):7880.