RNA干扰抑制存活表达对顺铂诱导结肠癌细胞株HCT116凋亡的影响

【摘要】 目的 探讨存活素(survivin)干扰提高结肠癌细胞株HCT116对顺铂(CDDP)敏感性的有关机制。方法 在HCT116细胞中，用lipofectamine 2000转染survivin的siRNA序列;荧光定量PCR检测survivin mRNA的表达;Western印迹检测survivin蛋白的表达;用流式细胞术法检测细胞凋亡率。结果 survivin的siRNA的转染显著降低了survivin蛋白的表达;瞬时转染survivin siRNA序列的HCT116细胞对低浓度(1.0 μg/ml)的CDDP作用下，凋亡率较阴性对照组明显升高。结论 survivin的干扰可以使survivin表达下调，诱导细胞凋亡，提高结肠癌细胞株HCT116对CDDP的敏感性。

【关键词】 存活素;siRNA;细胞凋亡

存活素(survivin)是凋亡抑制蛋白家族中的最小成员〔1〕，因其抑制凋亡的作用很强，在肿瘤的研究中有重要价值〔2〕。Survivin在结肠癌组织中过度表达，对结肠癌的发生与发展过程中起重要作用〔3，4〕。近年来研究发现survivin与抗肿瘤药物的耐药性密切相关〔5〕。因此本实验使用RNA干扰技术降低survivin在结肠癌细胞株HCT116中的表达，检测survivin表达抑制细胞对低浓度化疗药物顺铂(CDDP)的敏感性，探讨结肠癌细胞对细胞毒性药物CDDP作用不敏感的产生及可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂 DMEM、Trizol购自Invertrogen公司。胎牛血清购自四季青公司。AnnexinVPI细胞凋亡检测试剂盒、蛋白定量试剂盒、蛋白Marker及ECL发光试剂盒均购自凯基公司。青链霉素、胰酶购自吉诺公司。荧光定量PCR试剂盒购自Takara公司，引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。Survivin抗体购于Santa Cruz公司。 内参βactin、辣根过氧化物标记二抗购自北京中山公司。siRNA由上海吉玛公司合成。细胞购于生科院细胞所。CDDP购自山东齐鲁制药厂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养及转染 HCT116细胞在DMEM培养液(含10%胎牛血清，100 U /L 青霉素，100 U /L 链霉素) 中，37 ℃，5% CO2培养箱中培养。HCT116细胞接种于六孔培养板中，接种24 h后使用Lipofectamine2000进行转染。分别转染阴性对照siRNA与survivin特异性siRNA 5′GGACCACCGCAUCUCUACATT3′。

　　1.2.2 AnnexinVPI检测细胞凋亡 收集1×105细胞PBS洗涤2次，以200 μl的Binding Buffer悬浮细胞;加入5 μl AnnexinvFITC混匀，加入5 μl PI混匀。室温避光15 min，流式细胞仪检测。

　　1.2.3 使用Trizol提取细胞总RNA 6孔培养板每孔中加入1 ml的Trizol裂解细胞，反复吹打3 min后将细胞裂解物移入1.5 ml的EP管内。静置5 min后每1 ml的Trizol加0.2 ml氯仿，盖紧样品管盖，用力摇晃EP管15 s并将其置于室温下孵育5 min。在4 ℃下以4 200 r/min高速冷冻离心15 min。将水样层移到一干净的EP管中，加入等体积的异丙醇，混合后将样品冰盒上放置30 min使RNA析出，在4 ℃下以4 200 r/min高速冷冻离心10 min。 移去上层悬液，用1 ml的75%乙醇再洗涤RNA 1次，将75%乙醇移去，简单干燥RNA沉淀，用无RNA酶水溶解RNA，并在56℃孵育5 min。1∶50稀释测定浓度，样品保存于-80℃。

　　1.2.4 RT PCR检测 Survivin mRNA的表达，引物均由上海英俊生物技术有限公司合成，序列为:5′TTCGTCCGGTTGCGCTTTCC3′(正链)，5′TCGATGG CACGGCGCACTTT3′(反链) 和βactin 5′TGGCACCACACCTTCTACAAT3′(正链)，5′AGAGGCGTACAGGGATAGCA3′(反链)。反应体系使用Takara公司试剂盒，反转录反应条件42 ℃，15 min;85 ℃，5 s。PCR反应条件 95℃，10 s，1个循环;95 ℃ 5 s，60℃ 20s，40个循环。F(Fold)=2-△△CT，△△CT=(CT.TargetCT.Actin)treated (CT.TargetCT.Actin)control。

　　1.2.5 全细胞蛋白提取 预冷的PBS轻轻洗涤瓶中贴壁的细胞，6孔培养板每孔中加入100 μl细胞裂解液融解细胞，同时用细胞刮子收集细胞，以上在冰上操作，细胞裂解液进行离心沉淀，取上清测其总蛋白浓度，剩余冻存于70℃待用。

　　1.2.6 免疫印迹检测survivin蛋白的表达 提取总蛋白进行 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜5 min×4，二抗室温孵育1 h，ECL发光试剂盒显色，曝光。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS11.5 软件，计量资料以x±s表示。多组间的均数比较采用单因素方差分析(oneway ANOVA)。

　　2 结 果

　　2.1 RNA干扰对survivin mRNA表达的影响 survivin特异性siRNA转染48 h后，RTPCR检测survivin在mRNA水平上的表达变化，阴性对照组细胞和对照组细胞相比(97.57%与100%)无明显变化，而survivin特异性si RNA干扰组则下降了68.4%，与对照组及阴性对照组比均有明显降低(P<0.05)。见图1。

　　与阴性对照组比较：1)P<0.05

　　图1 HCT116细胞survivin mRNA表达的变化

　　图2 HCT116细胞survivin蛋白表达的变化2.2 RNA干扰对survivin 蛋白表达的影响 survivin特异性siRNA转染60 h后，Western印迹检测干扰后survivin蛋白水平上的表达变化，通过灰度值比较显示阴性对照组细胞和对照组细胞相比无明显变化，而survivin特异性siRNA干扰组则下降了53.1%，与对照组及阴性对照组比均有明显降低。见图2。

　　2.3 RNA干扰细胞对低浓度CDDP敏感性的影响 RNA干扰细胞与阴性对照组细胞分别以低浓度(1 μg/ml)CDDP处理24 h，流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。阴性对照组细胞，CDDP处理组(5.18%)与未处理组(5.65%)细胞凋亡无显著差异(P>0.05);而RNA干扰组细胞，CDDP处理组(29.66%)与未处理组(7.01%)比较明显增加(P<0.05 )。

　　3 讨 论

　　survivin基因最显著的特征是在肿瘤组织与正常组织中差异表达，即在肿瘤组织中高表达，在正常组织中不表达或低表达〔6，7〕。近年来研究发现survivin基因与结肠癌的发病有密切关系，在结肠癌组织中survivin的高表达是结肠癌患者预后不良的重要指标〔8〕。以往的研究也证实，多种结肠癌细胞株中survivin为高表达，从另一个方面提示survivin的过度表达可能与结肠癌的形成及预后相关。

　　目前临床结肠癌对化疗上存在一个难题就是结肠癌对化疗药物敏感性差，研究显示survivin高表达的结肠癌细胞可以在细胞毒性药物环境中存活并获得耐受〔9，10〕。Survivin高表达可能通过抑制caspase3的激活，从而抑制细胞毒性药物诱导的细胞凋亡，提示survivin可能成为结肠癌治疗中的一个靶点〔11〕。

　　本研究中在结肠癌细胞株HCT116中瞬时转染了survivin特异的siRNA序列，survivin在mRNA及蛋白水平上均有明显下降，建立survivin低表达的HCT116细胞模型。使用低剂量化疗药物CDDP处理survivin干扰组及阴性对照组细胞，发现survivin干扰组细胞凋亡率明显增高。提示survivin为高表达是结肠癌对化疗药物敏感性差的重要原因，这对临床上结肠癌对化疗药物敏感性机制的探讨和研究有重要的意义。

参考文献

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