缺氧诱导因子1α在老年性痴呆模型鼠海马中的表达

　　　　　　 作者：刘凌云 马媛媛 李欣 柴锡庆

【摘要】 目的 观察老年性痴呆(AD)大鼠行为学、海马神经细胞凋亡率及缺氧诱导因子(HIF)1α表达水平的变化。方法 侧脑室注射Aβ25～35构建AD大鼠模型，Morris水迷宫实验测试大鼠空间学习记忆能力，流式细胞术检测海马神经细胞凋亡率， Western印迹技术检测大鼠海马HIF1α蛋白的表达。结果 Morris水迷宫实验结果显示AD组大鼠平均逃避潜伏期显著延长(P<0.05)，流式细胞分析结果显示，AD组海马神经细胞凋亡百分率较正常对照组显著升高(P<0.05)，Western印迹检测结果显示，AD组海马神经细胞HIF1α蛋白表达水平较正常对照组显著升高(P<0.05)。结论 侧脑室注射Aβ25～35成功构建AD大鼠模型并上调海马神经细胞HIF1α水平表达。

【关键词】 阿尔茨海默病;缺氧诱导因子1 α;β淀粉样蛋白;海马

老年性痴呆亦称阿尔茨海默病(AD)，是中枢神经系统一种慢性、进行性变性疾病，以认知功能障碍、老年斑、神经原纤维缠结、颗粒空泡变性为特征〔1〕。AD发病机制目前尚未完全阐明，β淀粉样蛋白(Aβ)学说认为Aβ是AD发病始动因素，Aβ异常沉积导致大量神经细胞死亡，出现智能减退等临床症状。但是Aβ异常沉积区域仍有少量神经细胞存活，有学者还从中成功筛选出了能够耐受Aβ毒性的PC12细胞株〔2，3〕，Semenza等〔4〕认为这些细胞得以生存的机制可能与糖代谢及缺氧诱导因子(HIF)有关，值得深入探讨。HIF1α是一种在缺氧应答过程中起重要作用的核转录因子，广泛参与缺氧诱导的细胞适应性反应，是缺氧应答时基因表达和恢复细胞内环境稳定的调节中心〔5〕。Soucek等〔6〕证实HIF1α能够减轻Aβ神经毒性作用，其机制可能与激活糖酵解、磷酸己糖途径促使还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸生成增加，降低细胞内活性氧含量，减弱氧化应激造成的神经损伤以及促进葡萄糖载体蛋白1、醛缩酶A、乳酸脱氢酶A及磷酸果糖激酶蛋白水平表达上调，从而促进糖的转移、利用，改善脑组织能量代谢途径等有关，这为治疗AD提供新的研究方向。因此，本研究通过侧脑室内注射Aβ25～25建立AD动物模型，观察大鼠行为学、海马神经细胞凋亡率及HIF1α蛋白含量变化，探讨Aβ、HIF1α、细胞凋亡之间的关系，为临床防治AD提供新的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂 Aβ25～35、抗人HIF1α单克隆抗体及多聚赖氨酸购自Sigma公司;二抗购自北京鼎国生物技术有限责任公司;DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2 动物 健康雄性SD大鼠16只，体重200～250 g，由河北医科大学实验动物中心提供，在实验室常温饲养1～2 d后用于实验。动物随机分为2组，每组8只：①AD模型组(AD组)：右侧脑室注射2 μl Aβ25～35(10 mg/ml);②对照组：右侧脑室注射2 μl生理盐水;以上2组动物于注射Aβ25～35或生理盐水4 w后观察大鼠行为学、海马神经细胞凋亡率及HIF1α蛋白表达。

　　1.3 Aβ的老化处理 将Aβ25～35溶解在高压灭菌生理盐水内，贮存液浓度10 g/L，过滤除菌，-20℃保存。临用前37℃孵育4 d，使其变为聚集状的Aβ。

　　1.4 AD动物模型的复制 大鼠以10%水合氯醛(350 mg/kg体重)腹腔注射麻醉后，江湾Ⅰ型C立体定位仪固定头部，剪开头皮，暴露头骨，于前囟后0.8 mm，中线右侧旁开1.5 mm，用牙科钻钻开颅骨，微量注射器自脑表面垂直进针4.0 mm，于右侧脑室内缓慢(0.5 μl/min)注射2 μl Aβ25～35(10 mg/ml)留针5 min后慢慢退出。庆大霉素局部消毒，缝合皮肤，自由进食。对照组相同部位注射等容积生理盐水。

　　1.5 Morris水迷宫测试 大鼠在给药的4 w后开始水迷宫检测，采用定位航行试验，历时4 d。第1天让大鼠自由游泳2 min以熟悉水迷宫环境，从第2天起，每天分上、下午两个时间段，每个时间段训练4次，每次训练间隔4 min，每次分别从4个不同的标记点，将大鼠面向池壁放入水中，记录:2 min内寻找平台所需时间(s)，即逃避潜伏期(EL)。将各次训练的EL取平均值，反映大鼠学习记忆能力。

　　1.6 流式细胞术检测海马神经细胞凋亡率 大鼠于侧脑室注射Aβ25～35后5 w断头处死，迅速取出脑组织置于0～4℃生理盐水冲洗表面血迹，在冰盘上分离出海马后放入70%乙醇中固定，4℃保存。将固定好的组织放在120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，然后用眼科镊子轻轻揉搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直到将组织搓完为止。将平皿中的混悬液用300目铜网过滤去除细胞团块，收集细胞悬液，离心2 min(1 000 r/min)，加入含有50 mg/ml的碘化吡啶和100 mg/ml的无DNA 酶污染的RNA酶，PBS染色液，置4℃避光染色1 h，上机检测。

　　1.7 Western印迹检测大鼠海马HIF1 α蛋白的表达 大鼠于侧脑室注射Aβ25～35后5 w断头处死，迅速取出脑组织置于0～4℃生理盐水冲洗表面血迹，置冰盘中快速分离双侧海马，以1∶9 (即100 μg重量加入900 μl体积)的比例加入蛋白裂解液，冰水中用1 ml匀浆器制10%的蛋白匀浆，匀浆在10 000 r/min离心10 min，取上清，考马斯亮蓝蛋白定量分析。按100μg/孔加样量计算应加细胞核提取物的体积。7.5%十二烷基硫酸钠聚丙烯凝胶电泳(SDSPAGE)分离蛋白后，100 V电转移3 h至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜，PBS清洗PVDF膜。加入小鼠抗人HIF1 α(1∶1 000)单克隆抗体，4℃孵育过夜，PBS清洗。加入 HRP兔抗小鼠抗体二抗(1∶2 000)，37℃孵育1 h，PBS清洗。DAB法显色，照相，以Labworks4.0软件测定积分光密度进行统计分析。

　　1.8 数据处理及统计学 计量资料以x±s表示，用SPSS11.0统计软件的t检验进行组间比较。

　　2 结 果

　　2.1 行为学变化 Morris水迷宫实验结果可见，AD组大鼠平均EL(30.85±6.51)s，较对照组(13.79±4.67)s显著延长(P<0.05)。

　　2.2 海马神经细胞凋亡百分率 流式细胞分析结果显示，AD组海马神经细胞凋亡百分率为19.49%±2.59%，较对照组(5.28%±0.66%)显著升高(P<0.05)。

　　2.3 HIF1α蛋白的表达 Western印迹检测结果显示，AD组海马神经细胞HIF1α蛋白平均光密度值(292.79±29.58)，较对照组(202.23±37.24)显著升高(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　近年来，人们在建立AD动物模型方面进行了大量的研究，虽然还没有一个能完全反映AD组织病理变化和行为能力缺损的理想的动物模型，但人们已经建立起许多能反映部分AD特征的动物模型，这些模型对研究AD病因、病理过程，开发有效治疗药物具有重要意义。本研究结果提示侧脑室注射Aβ25～35可诱导海马神经细胞凋亡，诱导大鼠出现学习记忆能力减退，以上结果表明，本实验成功构建了AD模型。

　　研究证实，HIF1α具有神经保护作用，能够抑制神经细胞凋亡〔6〕。本实验发现，AD模型组HIF1α表达水平明显高于对照组，提示Aβ25～35可能HIF1α表达诱导上调，但是HIF1α并没有抑制Aβ25～35诱导神经细胞凋亡，考虑可能与以下两方面因素有关，①Aβ创造了一个神经细胞缺氧环境，缺氧抑制了天冬酰胺羟化酶和脯氨酸羟化酶的羟化作用，促进了HIF1α基因转录，增加HIFlα蛋白的稳定性，阻止了HIF1α降解，从而升高了HIF1α表达〔7〕;②Aβ通过氧化应激、兴奋性氨基酸毒性损伤、炎性损伤等途径促使神经细胞凋亡〔8〕，HIF1α通过激活糖酵解酶，降低代谢耗氧，减少活性氧产生，抑制促凋亡分子Bid转录及caspase凋亡级联反应等途径阻止细胞凋亡〔9，10〕，本实验中HIF1α虽然较对照组显著升高，但HIF1α仅能调控凋亡发生部分环节，但尚不能完全抵消Aβ25～35的促凋亡作用，即在本模型中Aβ25～35促凋亡因素占主导作用，因此，采取相应措施进一步促进HIF1α表达可能逆转Aβ神经毒性作用，有望为AD防治提供一种新的选择。

参考文献

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