丹参酮对D半乳糖Aβ140致痴呆大鼠海马内Aβ和AChE的影响

【摘要】 目的 探讨丹参酮对D半乳糖Aβ140致复合痴呆模型大鼠海马内β淀粉样蛋白(Aβ)和乙酰胆碱酯酶(AChE) 表达的影响。方法 实验动物随机分成AD模型组、丹参酮治疗组和溶媒对照组。采用免疫组织化学和酶组织化学方法，分别观察大鼠海马内Aβ和AChE表达的变化。结果 AD模型组大鼠海马内Aβir细胞数显著增多，平均光密度增强;AChE阳性神经纤维受损，光密度下降 (含阳性面积百分比和光密度);与溶媒对照组比较差异显著(P<0.01)。丹参酮处理后，Aβir细胞数明显减少，光密度也下降;AChE阳性神经纤维密度增强，与AD模型组比较差异有显著性意义(P<0.01)。结论 丹参酮改善D半乳糖Aβ140致复合痴呆大鼠学习记忆障碍的作用机制，可能与降低海马内Aβ的表达而保护脑内胆碱能神经有关。

【关键词】 丹参酮;D半乳糖;β淀粉样肽蛋白;乙酰胆碱酯酶;海马

【Abstract】 Objective To investigate influence of tanshinone on levels of βamyloid (Aβ) and acetylcholinesterase (AchE) in hippocampus of dementia model rats induced by Dgalactose combination with Aβ140.Methods Rats were randomly pided into Alzheimer′s disease (AD) model， tanshinone treatment， and solvent control groups. The expression of Aβ and AChE in rats hippocampus were respectively observed by immunohistochemical and enzymehistochemical methods. Results Aβir cells count and the average optical density of AD rats in the hippocampus were obviously increased， AChE positive nervous fibers damaged， optical density of AChE positive nervous fibers were significantly decreased in AD model group compared with solvent control group. After treated with tanshinone， Aβir cells count and the optical density obviously decreased， AChEpositive nervous fibers were significantly increased compared with AD model group. Conclusions Mechanism of tanshinone on improving learning and memory impairment dementia model rats induced by Dgalactose combination with Aβ140 might be related to decreasing expression of Aβ in hippocampus and protecting cholinergic nerves in brain.

　　【Key words】 Tanshinone; Dgalactose; βamyloid peptide protein (Aβ); Acetylcholinesterase (AChE); Hippocampus

　 阿尔茨海默病(AD)〔1〕是严重影响老年人健康的常见病、多发病，在欧、美等国家已成为继心血管病、肿瘤及中风之后的第4位死亡原因。各种原因导致的中枢神经系统内β淀粉样前体蛋白(APP)的过多表达，APP被降解导致过量的β淀粉样蛋白(Aβ)产生是启动AD发病的关键因素。Aβ是AD患者脑内老年斑的主要成分，凝聚态的Aβ具有神经毒性被认为是细胞凋亡过程的诱导因素〔2，3〕。AD患者表现出中枢胆碱能系统功能紊乱，神经递质乙酰胆碱 (ACh) 及其合成酶胆碱乙酰化酶(ChAc)缺失的程度与AD密切相关〔4〕。有报道，丹参酮ⅡA和ⅡB能减少小鼠短暂的 (急性) 局灶性脑缺血的脑梗死灶体积，并可能有神经保护作用〔5〕，还能改善缺血再灌注损伤小鼠和东莨菪碱(抗胆碱药)诱发的空间行为缺陷小鼠的学习、记忆障碍〔6〕。但就丹参酮对D半乳糖Aβ140诱发复合痴呆(记忆障碍)病变大鼠的作用未见报道。本研究采用腹腔注射1.25% D半乳糖致衰老加双侧海马微量注射Aβ140诱发AD样痴呆 (记忆障碍) 大鼠模型，以观察海马内ACh的降解酶乙酰胆碱酯酶 (AChE) 和Aβ表达的变化，同时观察丹参酮改善大鼠学习记忆障碍的神经化学机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 雄性SD大鼠45只，鼠龄3～4月，清洁二级，体重250 g左右(华中科技大学同济医学院实验动物学部提供)。实验动物随机分成3组：AD模型组15只;丹参酮治疗组20只;溶媒对照组10只。

　　1.2 主要试剂及仪器 Aβ140、DAB (Sigma公司，美国)，AβSP免疫组织化学试剂盒(ZYMED公司，USA)，生物素标记羊抗兔IgG工作液、辣根酶标记链霉卵白素 (SA/HRP) 工作液 (北京中山生物有限公司)，丹参酮 (华中科技大学同济医学院临床药理学教研室惠赠)。江湾Ⅰ型脑立体定位仪 (上海川沙花木农机厂)，Y型水迷宫(中国医学科学院药物所研制)，AO恒冷箱切片机(AO公司，美国)，HPIAS1000彩色病理图文分析系统(华中科技大学同济医学院清屏影像工程公司组装)。

　　1.3 造模方法 全部大鼠在实验前应用Y型水迷宫进行学习记忆功能的检测，选取学习记忆功能正常的大鼠随机配组实验;每组动物造模完成后，分别采用水迷宫试验鉴定动物模型。

　　1.3.1 实验动物学习记忆功能的测试 采用Y型水迷宫试验监测大鼠学习记忆功能。记录大鼠平均逃避潜伏期 (从入水起点至寻找到阶梯出水的时间) 和进入盲端的错误次数 (逃避错误频率，次/3 min)。预训练4 d，每天2次，每次训练时间定为3 min，3 min仍未找到安全通道者以180 s计算。训练第1天让大鼠自由游泳，第2～4天训练时，试验者可引导大鼠进入安全通道。按照Zealonga 5级评分法〔7〕，在造模大鼠清醒后，立即进行动物神经功能的评定。评分标准为：正常 (0分);对侧肢体屈曲 (1分);拖鼠尾后拉时，对侧肢体无力(2分);拖鼠尾后拉时，向对侧转圈(3分);自发向对侧转圈或倾倒(4分)。选取评分为2分及以上造模大鼠入围实验。

　　1.3.2 D半乳糖腹腔注射 参照文献〔8，9〕以无菌生理盐水配制1.25% D半乳糖溶液。AD模型组和丹参酮治疗组按50 mg·kg-1·d-1的标准计算相应的D半乳糖盐液量，腹腔注射，连续6 w。溶媒对照组大鼠与AD模型组同法腹腔注射等量的生理盐水。

　　1.3.3 Aβ140海马注射 在D半乳糖连续处理6 w后的第2天，施行Aβ140海马注射。大鼠腹腔注射10%水合氯醛 (0.35 g/kg) 麻醉，头顶部去毛，消毒皮肤并切开1.5 cm长切口，暴露颅骨和前囟。用牙科钻头钻开颅骨，在海马齿状回背侧 (参照大鼠脑立体定位图谱，定位坐标为前囟后3.5 mm，脑正中线旁开2.0 mm，深度2.7 mm) 缓慢注入Aβ140各1 μl (10 μg Aβ140溶于1 μl无菌生理盐水，用前37℃下孵育1 w，使其凝聚老化)。注射完毕后留针5 min(保证溶液充分扩散)，然后缓慢起针。蜡封闭针孔，撒消炎粉止血消炎，缝合皮肤。溶媒对照组大鼠与AD模型组同法，于海马区注射等量的生理盐水1 μl。术后将大鼠放回鼠笼中常规饲养。并肌注青霉素抗感染(40万U/d·只，连续7 d)。丹参酮治疗组在D半乳糖Aβ140复合造模后24 h，部分模型组大鼠给予丹参酮〔10〕，丹参酮均按50 mg·kg-1·d-1溶于5 ml玉米油中灌胃;溶媒对照组及AD模型组仅以等量玉米油灌胃;各连续14 d。

　　1.4 染色方法 实验大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，经左心室升主动脉灌注生理盐水100 ml，随即快注冷的4%多聚甲醛固定液 (4℃，pH7.3) 100 ml，然后慢速灌注多聚甲醛液200 ml。开颅取脑，标本入20%、30%蔗糖磷酸缓冲液 (PB 0.1 mol/L，pH7.4) 中，制作海马冠状恒冷箱切片，片厚25 μm，PB接片，收集全部切片，做形态学各项指标检测。

　　1.4.1 AβSP免疫组织化学法 部分切片采用链霉卵白素生物素复合法进行Aβ免疫染色。切片依次入0.25% Triton X100，37℃预处理30 min;正常10%小牛血清室温20 min;一抗 (Aβ抗体) 工作液，室温孵育2 h，转入4℃孵育12 h;二抗酶标羊抗兔IgG (HRPIgG，1∶100)，37℃ 30 min;SP复合物 (SA/HRP工作液)，37℃ 30 min;DAB/h3O2硫酸镍铵染色液显色。用PBS替代一级抗体作为阴性对照。每只实验大鼠随机选5张切片，200光镜视野下标定海马切片CA1和CA4区。利用HPIAS1000彩色图像分析系统分别测定海马各亚区的面积(S)和AChE阳性神经纤维的面积(S′)(阳性面积百分比：S′/S)，以及Aβir神经元胞体计数和平均光密度。

　　1.4.2 AChE组织化学法 部分切片入改良的KarnovskyRoots孵育液，37℃孵育2 h，0.05 mol/L TrisHCI缓冲液 (pH7.6) 漂洗切片，DAB/h3O2硫酸镍铵染色液显色。阳性神经纤维呈灰蓝色。

　　1.5 统计方法 所有数据以x±s表示，采用SPSS12.0 统计软件进行单因素方差分析和多组间均数比较。

　　2 结 果

　　2.1 丹参酮对海马内Aβir细胞表达的影响 溶媒对照组大鼠海马各板层均可见少量Aβir细胞，细胞大小不等，多为卵圆形或圆形，免疫反应阳性物质位于核周质，着色强弱深浅不一。Aβir神经纤维分布于海马各板层，细密网状。AD模型组各板层Aβir细胞数明显增多，阳性神经纤维浓密网状。丹参酮治疗组各板层Aβir细胞数及神经纤维分布状态介于上述二者之间。海马CA1区Aβir细胞数和平均光密度，结果显示，AD模型大鼠海马内Aβir细胞数明显增多，平均光密度明显增强，与溶媒对照组比较有明显差异(P<0.01)。丹参酮治疗组用丹参酮处理后，Aβir细胞数明显减少，平均光密度下降，与AD模型组比较差异有显著性意义(P<0.01)。见表1。表1 丹参酮对D半乳糖Aβ140处理大鼠海马内Aβir细胞的影响与溶媒对照组比较：1)P<0.01;与AD模型组比较：2)P<0.05

　　2.2 丹参酮对海马内AChE阳性神经纤维表达的影响 溶媒对照组海马各区 (层) 富含AChE阳性纤维末梢细密网，膨体丰富，其中多形细胞层、辐射层和分子层丰富，而锥体细胞层较少。在齿状回分子层AChE阳性纤维较密集，颗粒细胞和多形细胞层则较少。各区均见少量的AChE弱阳性反应细胞。AD模型组海马各区 (层) AChE阳性纤维网稀疏，着色浅，膨体少;注射区深部出现AChE阳性纤维受损迹象。丹参酮治疗组给予丹参酮处理后，海马内各区 (层) AChE阳性纤维的着色及密度界于上二组之间，亦即受损AChE纤维有一定程度的恢复。图像分析系统测定海马CA1、CA4区的AChE阳性纤维密度及所占面积，经统计学分析，结果显示AD模型组大鼠海马内AchE阳性神经纤维光密度下降，AchE阳性纤维面积百分比减少，与溶媒对照组比较差异有显著意义(P<0.01)。丹参酮治疗组用丹参酮处理后，AchE阳性神经纤维光密度增强。AchE阳性纤维面积百分比增加，与AD模型组比较差异有显著性意义(P<0.01或P<0.05)。见表2。表2 丹参酮对D半乳糖 Aβ140处理大鼠海马内AChE阳性神经纤维的影响与对照组比较：1)P<0.01;与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05

　　3 讨 论

　　3.1 痴呆动物模型的评价 AD主要行为改变为记忆能力下降和认知功能障碍，主要病理改变有老年斑和神经原纤维缠结〔1〕。建立模拟AD行为改变和病理特征的痴呆动物模型，对于AD治疗药物筛选，发病机制的研究有重要意义。本研究动物模型采用复合AD动物模型，即在腹腔注射D半乳糖致衰老的基础上于大鼠海马内微量注射Aβ140模拟复制AD痴呆动物模型。具有以下特点：①与人类AD发病机制有相似性，能仿真出AD的行为学改变;②能模拟复制出AD的主要病理改变;③与临床病症相仿;④技术稳定可复制。通过水迷宫试验评价，证明D半乳糖与Aβ140复合诱发大鼠AD模型较D半乳糖〔9〕或Aβ单一造模〔10〕优越。因此本模型更适用于AD样老年痴呆发病机制及治疗药物筛选的研究。

　　3.2 Aβ的神经毒性与AD AD患者老年斑中心主要成分Aβ是正常新陈代谢产物，一种跨膜蛋白，具有重要的生理功能，对神经细胞无毒害作用。但是，Aβ是一种疏水性很强的多肽，在水中溶解度较低，而且有很强的自聚性，在适宜条件下，当脑内Aβ>0.75 mg/ml时，Aβ能很快聚集成纤维。初时形成低聚体 (有一定神经毒性)，以后进一步聚集形成不溶性的Aβ纤维，具有长期的稳定性，在神经细胞内沉积。沉积的Aβ与退变细胞在脑内易损区 (基底核、海马、大脑皮质等) 逐渐累积，导致典型的老年斑形成，即纤维状Aβ产生了神经毒性作用，诱发神经元的凋亡、死亡和丧失，从而使AD患者出现认知功能减退与记忆障碍等痴呆症状。

　　Aβ的神经毒性作用被认为是多因素导致AD的共同通路〔2，3，11〕。AD患者脑内Aβ异常增多，使其不能被及时清除，在脑部沉积形成淀粉斑块后，斑块周围有时显现神经炎性改变，突触缺失。星形胶质细胞和小胶质细胞增生，最后导致神经细胞凋亡。本研究结果揭示丹参酮能抑制Aβ在脑内过度沉积、降低Aβ在脑内的表达，减轻Aβ的神经毒性作用，这可能是丹橙酮治疗AD、改善学习记忆功能的机制之一。

　　3.3 中枢胆碱能神经与AD 中枢胆碱能神经系统通过边缘系统和大脑皮层调节学习和记忆过程。在边缘系统中隔区内侧核和斜角带核发出的胆碱能神经纤维，经穹窿投射到海马，这条胆碱能通路与学习记忆密切相关，切断海马穹窿投射神经纤维，可导致学习记忆障碍。AD患者大脑内主要变化的神经递质是乙酰胆碱，在皮层、尾核中ChAC、AChE活性显著降低，同时主要发出胆碱能神经纤维向皮层投射的基底神经节的神经元也受损，ACh释放减少。本研究采用D半乳糖Aβ140复合造模后，海马内各亚区AChE阳性神经纤维也明显减少，提示Aβ可以损害胆碱能神经元〔12〕。治疗组大鼠用丹参酮(50 mg/kg·d)处理后，海马内Aβ的表达明显减少，而AChE酶活性增加，表明丹参酮能提高记忆功能的机制，可能是通过降低Aβ的表达，保护海马胆碱能神经免遭损害来实现的。

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