阿尔茨海默病基因治疗实验研究进展

　　　　　　 作者：孔卫娜 孙祎敏 张丽霞1 苏安英2 柴锡庆

【关键词】 阿尔茨海默病;β淀粉样蛋白;基因治疗

阿尔茨海默病(AD)主要症状为进行性记忆力和认知力减退。目前，药物治疗仍是治疗AD的主要手段，但现在所开发的药剂多为化学合成药，药物作用位点不专一，特异性弱。相反，采用基因治疗的方法不仅定位准确，作用持续时间长，而且没有非靶器官的副作用，是一种较为理想的治疗方法。此外，虽然研究证实AD是一种多病因介导的疾病，但是脑内β淀粉样蛋白(Aβ)代谢异常造成的Aβ片段聚集沉积引发的级联反应是AD的主要致病原因。Aβ的稳态水平依赖于生成、清除和内流间的平衡，因此，若能通过基因治疗的手段减少Aβ生成或上调酶介导的Aβ降解，促进受体介导的Aβ脑外流，抑制Aβ脑内流，便可有效地治疗AD。

　　1 降低Aβ生成的基因治疗

　　Aβ由分泌酶水解β淀粉样前体蛋白(APP)产生。体内有α、β、γ三种分泌酶参与APP的降解。α分泌酶的酶切位点位于APP蛋白中部，避免了完整Aβ分子序列的产生，且分解产生的可溶性淀粉样前体蛋白α(soluble amyloid precursor protein α，sAPPα)对神经细胞具有神经营养和神经保护作用，是正常人体内APP的主要代谢方式;β分泌酶使APP裂解成游离的sAPPβ及仍结合在膜上的CTF99，CTF99再被γ分泌酶水解，生成P3和含有39～42个氨基酸残基的Aβ，Aβ(尤其是Aβ40和Aβ42)聚集形成淀粉样斑块，产生神经毒性。

　　1.1 APP基因 APP基因突变形成新的酶切位点，易为β、γ分泌酶(尤其是γ分泌酶)水解，进而产生大量的Aβ40和Aβ42，促进了淀粉样斑块的形成。用携带siRNA的单纯疱疹病毒载体封闭APP突变基因的表达有效阻断了AD小鼠海马淀粉样斑块的形成〔1〕。

　　1.2 α分泌酶 α分泌酶及β、γ分泌酶两个酶系统对同一底物APP进行竞争。如果α分泌酶活性增强，既生成了对细胞具有营养作用的sAPPα，又减少了Aβ的产生，因此提高α分泌酶的活性或表达，利于对AD的治疗。

　　α分泌酶不是单一的蛋白酶，而是一类膜结合蛋白。金属蛋白酶10(adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)具有α分泌酶的生物学功能。Colciaghi等〔2〕发现在AD患者中，ADAM10的水平降低，且随疾病的进展，其下降程度增加。通过转基因技术，使AD模型小鼠神经元中适度过表达ADAM10基因，sAPPα的分泌增加，淀粉样斑块的生成减少;相反，转染ADAM10突变基因的AD模型小鼠，脑内淀粉样斑块的沉积加剧〔3〕。这些结果在一定程度上提示了ADAM10对于AD具有潜在的治疗作用。ADAM10并非唯一的α分泌酶，过表达ADAM9、ADAM17或ADAM19的细胞，sAPPα的分泌也增加。因此，它们也是α分泌酶的活性成分之一，但其在AD治疗中的潜在作用还需要进一步的研究。

　　1.3 β分泌酶 1999年，Vassar等〔4〕用基因筛选的方法纯化出一种新的、在β分泌酶位点剪切APP的蛋白酶，称之为APP的β位点剪切酶(betasite APPcleaving enzyme 1，BACE1)。细胞实验显示，将化学合成的针对BACE1的siRNA转染APP基因突变小鼠神经元，干扰内源BACE1基因的表达，Aβ的生成下降〔5〕。Kobayashi等〔6〕的研究也发现BACE1基因敲除的AD模型小鼠的大脑Aβ沉积显著降低。构建BACE1 siRNA的慢病毒表达载体，将载体注射到AD模型小鼠海马中，小鼠海马组织BACE1的表达显著下降，Aβ的生成及淀粉样沉积显著降低，小鼠的行为学缺陷也得到一定改善〔7〕。

　　BACE2和BACE1同样具有剪切APP的功能，但它主要在Aβ序列的19Phe20Phe和20Phe21Ala部位进行剪切，破坏完整Aβ的形成而具有了类似α分泌酶的作用。BACE2与BACE1相互拮抗，竞争同一作用底物APP，从而抑制Aβ的生成。用慢病毒载体介导BACE2基因转染AD模型小鼠，BACE2在神经元内高表达，小鼠脑内Aβ的沉积显著降低〔8〕。

　　1.4 γ分泌酶 γ分泌酶是一组复杂的多亚基复合体，早老素(presenilin，PS)1和PS2为同源异构体，是γ分泌酶的组分之一。PS1和PS2基因突变可使Aβ42的水平选择性升高。APP、PS1和PS2基因突变被认为与早发型AD密切相关。除PS是γ分泌酶复合体组分外，还有Nicastrin(Nct)、APH1和PEN2，任一组分表达水平下调均将导致γ分泌酶复合体形成障碍。例如，用siRNA抑制细胞PS1的表达，γ分泌酶活性下降的同时，细胞中Aβ42的生成也显著降低〔9〕。γ分泌酶的相关研究为AD基因治疗提供了新的靶点，但其仍有待于深入的研究。

　　2 加速Aβ降解的基因治疗

　　降解Aβ的酶有很多种，主要是脑啡肽酶(Neprilysin，NEP)、内皮素转化酶(endothelinconverting enzyme，ECE)和胰岛素降解酶(insulin degrading enzyme，IDE，也称insulysin)。此外，还有纤维蛋白溶酶(plasmin)、组织蛋白酶B(cathepsin B，CatB)等。

　　2.1 NEP NEP属中性M13Zn金属蛋白酶家族，是位于脑神经轴突和突触膜上的II型跨膜糖蛋白，主要在黑质纹状体通路表达，海马和大脑皮质也有表达。NEP的催化位点暴露在细胞外，是脑中细胞外不溶性Aβ的主要降解酶。NEP水平及活性的降低会导致Aβ的沉积，促使AD的发生。研究发现，随年龄的增长，NEP的表达下降。AD患者大脑皮层和海马处NEP的活性和水平也显著降低〔10〕。用慢病毒载体、腺相关病毒载体或单纯疱疹病毒载体将NEP基因导入AD模型小鼠脑中，显著降低脑内Aβ水平，减少淀粉样斑块的沉积，降低氧化应激和炎症反应，抑制海马和额叶的神经病变，提高了AD小鼠的空间识别能力〔1，11〕。

　　2.2 ECE ECE也是M13Zn金属蛋白酶家族的一员，参与脑内Aβ的降解。细胞学研究显示，抑制ECE的活性，Aβ的聚集增加;ECE过表达，Aβ的聚集减少。动物实验研究显示，ECE基因缺失的小鼠脑内Aβ的水平升高〔12〕;相反，将表达ECE的重组腺相关病毒注射到AD模型小鼠大脑皮层及海马中，注射部位Aβ水平显著降低〔13〕。

　　2.3 IDE IDE位于神经元细胞膜上，主要参与细胞内可溶性Aβ单体的降解。随年龄增长，脑IDE的水平逐渐下降。敲除IDE基因，小鼠脑中Aβ的降解下降，脑内Aβ水平显著升高。IDE基因缺陷也将导致AD患者皮层微血管Aβ累积，形成脑淀粉样血管病变。通过转基因技术使AD模型小鼠脑IDE的表达增加了约2倍，显著降低脑Aβ的水平，延迟或完全预防脑中淀粉样斑块的形成〔14〕。

　　2.4 Plasmin Plasmin介导的酶解过程除了在纤溶、细胞迁移等病理生理过程发挥作用外，也参与脑内Aβ的降解。有活性的plasmin是由组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，tPA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinasetype plasminogen activator，uPA)催化没有活性的血纤维蛋白溶酶原(plasminogen)而形成的。在AD模型小鼠脑中可见tPA和plasminogen共同表达于淀粉样沉积部位，对Aβ42降解起到了重要的作用。但在plasmin基因敲除小鼠脑中并未观察到内源性Aβ水平的升高，推测plasmin可能在Aβ聚集发生以后才发挥降解作用〔15〕。在AD患者或AD模型动物脑内，plasmin的表达与正常个体相比均显著降低。而用uPA或tPA和plasminogen联合应用均可显著降低AD模型小鼠脑内Aβ的沉积及淀粉样斑块的形成，为治疗AD提供了新的策略〔16，17〕。

　　2.5 CatB CatB也可以降解Aβ，尤其是Aβ42。抑制AD模型小鼠CatB基因的表达，Aβ42的表达升高，淀粉样沉积加剧。用慢病毒介导CatB基因转染老年AD模型小鼠，显著降低了已有的Aβ沉积〔18〕。CatB具有抗淀粉样沉积和保护神经作用。

　　3 加速Aβ转运的基因治疗

　　脑内Aβ的转运清除包括血脑屏障(bloodbrain barrier，BBB)转运和经非特异性脑间质液泵流到脑脊液后进入血液清除。脑内绝大多数的Aβ是经BBB途径转运出脑，10%～15%的Aβ由脑间质液泵流清除。可溶性Aβ通过BBB，是由受体介导的跨膜转运完成的：低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)和P糖蛋白(Pgp)介导可溶性Aβ由脑转运至血液，进而转移至肝脏降解;晚期糖基化终产物受体(RAGE)介导Aβ经血液由外周转运至大脑。

　　3.1 LRP 胞外可溶性Aβ与血管内皮细胞表达的LRP结合，经转胞作用过BBB进入血液循环;脑内可溶性Aβ通过脑间质液进入脑脊液同样需要LRP的介导;血清中还存在一种可溶性的LRP(sLRP)可以结合血清中70%～90%的Aβ，抑制血液中的Aβ进入脑内。AD患者或AD模型小鼠脑微血管LRP的表达与正常个体相比显著降低〔19〕。LRP基因缺失或表达量降低，造成AD模型小鼠脑Aβ沉积加剧，神经功能损伤加强。因此，增加血管内皮细胞LRP的表达或外周血液sLRP的含量，可有效降低脑中Aβ的积聚，为临床治疗AD提供了一条新的途径。2007年，Sagare等〔20〕利用重组型sLRPIV对AD模型小鼠进行治疗，显著降低了血管壁和脑中Aβ的沉积，改善了AD小鼠的学习记忆能力。

　　3.2 Pgp Pgp是一种膜结合蛋白，属于转运蛋白ATP结合物(ABCT)超家族成员之一，由MDR1基因编码。Pgp分布广泛，在担负重要生物屏障作用的脑毛细血管内皮细胞和肠上皮细胞中呈高表达。Pgp与多药耐药的产生关系非常密切，也参与脑脊液及BBB处的Aβ转运，介导Aβ的脑外流。Aβ40或Aβ42和Pgp相作用经囊泡转运出细胞。将Aβ40和Aβ42显微注射到Pgp基因缺失小鼠脑中，Aβ从脑内的清除速率与野生型小鼠相比下降了50%。抑制AD模型小鼠Pgp的活性，脑间质液中Aβ的水平在数小时内就有显著升高。敲除AD模型小鼠Pgp基因，脑内Aβ水平升高，Aβ的沉积加剧〔21〕。因此，增加Pgp的表达，促进Aβ的脑外流，降低脑内Aβ的水平，为治疗AD提供了又一可能，但目前尚未见此类报导。

　　3.3 RAGE RAGE是一种多功能的细胞表面受体，属于免疫球蛋白家族，分胞外域、跨膜域和胞内域。AD患者脑中过度的Aβ数量可上调RAGE的表达。脑微血管内皮细胞RAGE表达的升高，使RAGE介导的Aβ脑内流更加显著，加重了神经功能障碍;Aβ与小胶质细胞表达的RAGE相作用，促进前炎症因子的释放，导致持久的慢性神经炎症反应的发生;Aβ和神经元上的RAGE结合还将导致神经元存活率的下降〔22〕。Arancio等〔23〕通过转基因技术使AD小鼠脑中表达的RAGE缺乏胞内域，不能触发细胞内信号转导，缓解了Aβ诱导的神经功能损伤，使AD小鼠的学习记忆力得到了部分保留，神经病理表现也较轻微。此外，机体内还有一种RAGE缺乏跨膜域和胞内域，仅具备胞外域，可由细胞分泌出来进入血液循环，形成可溶性RAGE(sRAGE)，sRAGE与全长RAGE竞争和血液中的Aβ结合形成sRAGEAβ复合物，但是sRAGE不能穿过血脑屏障，抑制了Aβ的脑内流，从而间接抑制了RAGE的功能。目前，Deane等〔24〕将通过转基因技术获得的sRAGE对AD模型小鼠连续注射3个月，小鼠表现出较正常的空间识别和学习能力。

　　4 总结与展望

　　由于世界范围人口老龄化，AD发病率的日益上升，研制与开发安全有效的治疗方案面临巨大挑战。基因治疗以其特异性强、作用时间长、疗效好和副作用低等优势具有广阔的发展前景。目前，部分基因治疗在啮齿类和灵长类动物中已被证明安全有效，对人类的治疗正进入临床试验阶段，进一步临床研究正在进行中〔25，26〕。Aβ代谢相关基因更是因为其和AD的发展密切相关，越来越受到人们的关注，很有可能在不久的将来Aβ代谢相关的基因治疗会成为治疗AD的主要手段。

　　但要把基因治疗真正应用于临床，还需要克服许多技术上的困难和障碍。例如，携带目的基因的病毒载体本身会引起机体抗病毒的免疫反应，从而对组织器官产生损害。此外，上调或抑制Aβ代谢相关基因的表达，虽然可以治疗和预防AD，但这些基因产物除了参与Aβ代谢外，还参与其他的生理功能，其表达水平改变给治疗带来的副作用也不容忽视。例如：(1)敲除BACE1基因的AD模型小鼠，Aβ的沉积有所减少，但把正常小鼠的BACE1基因敲除，出现了意想不到的感觉运动障碍，空间记忆力衰退等症状。因此BACE1除了诱导Aβ的生成，其在正常的学习、记忆和感觉运动过程中也发挥着一定的作用〔27〕。(2)在封闭γ分泌酶表达的同时，还可能会影响到一些重要信号通路的传导(如Notch)。Notch为一膜蛋白受体，其介导的信号途径与胚胎发生、造血及神经干细胞分化、发育有关，因此有可能会带来一些严重的副作用。(3)除Aβ外，NEP还有很多作用底物，持续的NEP激活也会对机体造成伤害。例如，过表达NEP可以降低AD模型果蝇脑内Aβ42的沉积和神经元损伤，但同时也引发了年龄依赖的轴突衰退，使果蝇的寿命缩短了一半〔28〕。(4)临床上ECE抑制剂常被用于治疗高血压病，若上调ECE水平，有可能导致患者血压升高。(5)过多的plasmin的生成，易造成细胞连接降低。(6)LRP除介导Aβ的脑外流，还促进APP和BACE1发生相互作用，导致Aβ生成增加〔29〕。因此，研制更安全的病毒载体，选择性地提高或抑制Aβ代谢相关基因中与Aβ代谢相关结构域的表达将会成为AD基因治疗研究的重点。若这些问题能得到妥善解决，相信AD的彻底治疗也就为期不远了。

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