ApoE基因与人类老年性疾病的关系及ApoE基因敲除小鼠在人类老年疾病研究中的应用

【关键词】 心脑血管疾病;ApoE基因;多态性;ApoE基因敲除小鼠;动物模型

心脑血管疾病的病因与发病机制非常复杂，病毒因素、遗传因素、染色体及免疫功能都与其相关。目前已经发现多个基因与心脑血管疾病发生有关，其中，载脂蛋白E(Apo E)基因在心脑血管疾病中的作用被越来越多的认识。国外通过对大规模的人群进行分析，发现ApoE基因的多态性和老年性疾病息息相关〔1〕。

　　1 ApoE基因及表达产物

　　Apo E基因位于人类第19号染色体长臂l3区2带(19q132)上，长3.7 kb，包含4个外显子，3个内含子。其cDNA长为1.163 kb，基因的最初产物为含317个氨基酸的蛋白质，被一个含18个氨基酸的信号肽裂解后，变成由299个氨基酸组成的成熟蛋白〔2〕。ApoE蛋白主要由肝脏合成，在人体各组织细胞中都有表达，但在脑、肾、脾组织和巨嗜细胞中都有高表达〔3〕。Apo E基因有三种等位基因型：ε2，ε3和ε4，构成6种不同的基因型：3种纯合型(ε2/ε2、ε3/ε3、ε4/ε4)和三种杂合型(ε3/ε4、ε2/ε3、ε2/ε4)。根据其表型，分为E2基因型(ε2/2、ε3/2);E3基因型(ε3/ε3);E4基因型(ε4/3、ε4/2、ε4/4)。纯合子ε3/3作为ApoE3。E3是ApoE的野生型，各基因型频率因不同的种族和地区存在差异。在一般人群中，E2约占8%，E3约占78%，E4占14%〔4〕。 E2和E4基因型和E3相比，112和158位氨基酸残基(Cys/Arg)相互取代。突变的结果，E3和E4基因型比E2基因型对低密度脂蛋白受体(LDLR)亲和力高100倍〔1〕。

　　AopE是一种胆固醇转运蛋白，其对乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)的形成和维持它们的稳定极为重要。血浆中胆固醇水平主要是靠Apo E蛋白和LDLR的相互作用来调节的，由于Apo E2基因型对LDLR亲和力很低，因此，从血液到肝脏转运的LDL和CM的速率很低，诱导LDLR上调，最终导致血浆中的胆固醇降低而甘油三酯升高;而在Apo E4基因型中，血浆中的LDL和CM清除速度快，导致LDLR下调出现胆固醇升高而甘油三酯降低。而在Apo E3基因型中，血浆胆固醇和甘油三酯介于E4基因型和E3基因型之间〔5〕。

　　2 Apo E基因和心血管疾病的关系

　　美国心脏病协会估计，因心脏病死亡的患者数量，占全球总死亡数量的29%，而且随着许多国家老龄化人口的增加，该比例还在继续上升。在北美，65岁以上老人40%死于心血管疾病，一些风险因素，如高胆固醇，可能是动脉硬化、高血压以及其他心血管疾病的致病因素。而Apo E基因的多态性在调节血浆胆固醇水平中起重要的作用，是心血管疾病发生、发展的一个重要的分子靶标〔6〕。

　　1975年，Utermann等人的早期的分子流行病学调查发现：Apo E基因的多态性和Ⅲ型家族性高脂血症有关〔7〕，随后，发现，ε2基因型和高甘油三酯血症相关，而ε4基因型和高胆固醇血症相关。血液中高甘油三酯和高胆固醇都是心血管疾病发病的高致病因素。而且，在回顾性调查中发现，无论是青少年儿童还是中老年人血浆总胆固醇水平或低密度脂蛋白胆固醇水平均依下列顺序递增：ε2/ε2，ε2/ε3，ε2/ε4，ε3/ε3，ε3/ε4，ε4/ε4〔8〕。

　　3 ApoE基因和老年痴呆的关系

　　老年痴呆症，又称阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，指的是一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β淀粉样蛋白(βamyloid，βAP)沉积，神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)，大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑(senileplaque，SP)的形成。该病具有家族发病倾向，但也有普通人群的散发病病例。目前尚无特效治疗或逆转疾病进展的治疗药物。

　　Apo E蛋白是在大脑中合成的主要载脂蛋白，也是在脑脊液中发现的脂蛋白的成分之一。1991年，Namba等人发现，在βAP沉积和神经原纤维中，可以检测到Apo E蛋白成分，进一步研究证实Apo E蛋白能够和βAP形成前沉积样颗粒〔9〕。随后，Strittmater等人在研究家族性老年痴呆症病例时发现，该家族中含有很高频率Apo E的ε4等位基因。其出现的频率为0.5，大大高于普通人群频率(0.16)〔10〕。另外，在非家族性病例中，Apo E的ε4等位基因出现的频率也高于普通人群，为0.4。该结果提示Apo E的ε4等位基因可能和老年痴呆症存在关联〔11〕。因此，Apo E的ε4等位基因是老年性痴呆发病的高危因素。其可能原因是ApoE的ε4等位基因与βAP具有异常结合的能力，从而影响其有效的清除，导致βAP沉积异常积聚〔12〕。

　　4 Apo E基因敲除小鼠在心血管疾病研究中的应用

　　高胆固醇血症导致动脉硬化引发的心血管疾病是一种随年龄增长而发生的老年性疾病。在发现Apo E基因和心血管疾病的关联之前，因为没有一种动物模型来验证潜在的预防干预手段和评价治疗性药物的效果，研究人员只能进行回顾性的统计，研究心血管疾病的关联因素和讨论一些诊疗的可能性。而统计学的研究具有很大的局限性和不确定性。1992年，Piedrahita和zhang等人应用基因工程技术，在小鼠胚胎细胞中通过基因重组的方法，把Apo E基因从小鼠胚胎细胞的基因组中剔除掉。这样，发育的小鼠中就不表达Apo E蛋白。他们把这种小鼠称为ApoE基因敲除小鼠(ApoEKO mice，或ApoE/ mice)〔13〕。研究发现，当用高脂饲料喂养Apo E基因敲除小鼠时，小鼠老化进程很快，皮肤上出现肥胖条纹，皮下出现纤维瘤，血中胆固醇含量增高而且动脉出现粥样硬化等。另外，其巨噬细胞、T细胞和平滑肌细胞的生理反应和人类心血管疾病中的反应极为相似。因此，一方面，证实了Apo E基因在心血管疾病发生、发展中的重要作用。另一方面，更重要的是发现和建立了一种心血管疾病研究的动物模型。研究人员可以用Apo E基因敲除小鼠评价一些潜在的抗心血管疾病药物的疗效和行为干预的效果。

　　5 Apo E基因敲除小鼠在老年痴呆研究中的应用

　　1997年，Masliah等人的研究发现，Apo E基因和记忆相关，Apo E基因敲除小鼠的学习和记忆能力明显低于对照组。这可能是在Apo E基因敲除小鼠中，乙酰胆碱类物质供给不足造成的，接着把不同的Apo E基因型再引入Apo E基因敲除小鼠，结果发现Apo E基因ε3和ε4等位基因能够增强小鼠的学习记忆能力。但ε4等位基因与βAP具有异常结合的能力，容易导致βAP沉积异常积聚。这样反过来导致了老年痴呆的高发性。因此，Apo E基因ε3型可能作为基因治疗老年痴呆的一种手段〔14〕。

　　另外，HafeziMoghadam等人研究发现，在Apo E基因敲除小鼠中，血脑屏障的通透性很容易被破坏，其通透性是普通小鼠的3.7倍。导致一些非必需小分子化合物进入大脑，造成大脑功能的部分紊乱，这可能是老年痴呆发病的原因之一〔15〕。

　　6 Apo E基因敲除小鼠在其他老年性疾病研究中的应用

　　除了表现出心血管疾病和老年痴呆外，Apo E基因敲除小鼠还呈现出许多老龄化特征：如毛囊丢失、毛发褪色、生精细胞和生精小管退化、寿命缩短(高脂饲料饲喂7个月后极度老化，出现驼背、皮下肥胖、皮下肿瘤、肌肉萎缩、运动功能丧失等)〔16，17〕。因此，它也是研究老年性疾病较好的动物模型。除此之外，Apo E基因敲除小鼠还是研究糖尿病的一个理想的动物模型，当用链脲佐菌素(Streptozotocin)和普通饲料饲喂Apo E基因敲除小鼠时，小鼠出现Ⅰ型糖尿病的症状:高血糖和胰岛素缺乏症;而当用高脂饲料饲喂ApoE基因敲除小鼠时，小鼠表现为Ⅱ型糖尿病的症状：高血糖和高胰岛素症。因此，ApoE基因敲除小鼠还是抗糖尿病药物筛选的动物模型之一〔18～20〕。

　　7 结 语

　　越来越多的证据表明，Apo E基因在人类中老年疾病中扮演着非常重要的作用，在大规模人群的调查中发现，Apo E基因的多态性和多种人类衰老性疾病的病程发展密切相关。目前，研究最多的是心血管疾病和老年痴呆，Apo E基因的多态性可以作为诊断这些疾病的一个分子靶标，来参考疾病发生的可能性和发展的时间进程。研究Apo E基因的正常生理功能以及它和其他基因的关系，将有助于了解生命过程中基因和疾病的关系。Apo E基因敲除小鼠的出现，使研究人类衰老性疾病具有了可评估的动物模型，它将有助于进一步深化研究Apo E基因的功能，同时，为多种疾病的治疗提供了药物筛选的平台。但是，人体是一个极为复杂的系统，特别是人类衰老，是多种基因和环境共同作用的结果。Apo E基因在其中的作用，可能是极小的一部分。人类衰老的过程是多种蛋白和基因相互作用，相互制约的结果。因此，除了研究Apo E基因，还必须考虑和研究其他基因才能了解人类衰老相关发病机制。同时，由于小鼠和人体的差异性，以及单个基因的去除并不能代表自然的衰老过程，Apo E基因敲除小鼠模型只是一个非常局限的研究衰老性疾病的模型，还需要结合其他动物模型以及相关实验，才能使研究结果更趋于准确。

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