大蒜素对阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力和脑组织抗氧化能力的影响

　　　　　　作者：胡昔奇 李先辉 郑尧帆 龙颖 曹萍 张洁

【摘要】 目的 观察大蒜素对阿尔茨海默病(AD)小鼠学习记忆能力和脑组织抗氧化能力的影响。方法 采用 D半乳糖建立AD小鼠模型，大蒜素治疗组在造模的同时皮下注射大蒜素。通过行为学方法，观察大蒜素对AD小鼠记忆能力的影响;测定各组脑组织中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性;常规HE和镀银改良法染色观察小鼠海马及皮质的形态学改变。结果 模型组与对照组、大蒜素治疗组比较，小鼠记忆功能明显减退，神经细胞破坏明显，海马和皮质出现β淀粉样蛋白沉积及老年斑;大蒜素治疗组和对照组的丙二醛(MDA)含量较模型组显著降低(P<0.05)，SOD活性明显高于模型组(P<0.05)。结论 大蒜素在清除自由基和抗氧化损伤方面有显著功效，可以有效改善AD小鼠空间学习记忆能力损害。

【关键词】 大蒜素; 阿尔茨海默病; 行为学;抗氧化能力

　　　　 大蒜素是大蒜的主要成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗血小板聚集、提高免疫、清除自由基、护肝、降血脂、降血压及预防心血管疾病等生理学作用〔1〕。因其具有较好的脂溶性，可通过血脑屏障，因此在防治脑血管病方面的作用也备受关注。研究资料显示，大蒜素可改善血液流变性、增加脑血流量、清除自由基、改善脑功能及减轻急性脑梗死时缺血再灌注损伤〔2〕。大蒜素作为一种具有良好发展前景的天然抗氧化药物，具有抗氧化延缓衰老的作用〔3〕，同时对脑缺血再灌注大鼠海马神经元具有保护作用〔4〕，而氧化应激和海马神经元的损伤是阿尔茨海默病(AD)的主要发病机制。本研究采用D半乳糖致小鼠AD模型，从组织形态学角度，观察大蒜素对AD脑组织的保护作用及对小鼠学习记忆能力的改善作用，并对其抗氧化机制进行初步研究，为临床应用大蒜素防治AD提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 健康昆明雌性小鼠30只，清洁级，体重18～22 g，湖南长沙市开福区东创实验动物服务部提供，批准号：001847。

　　1.2 药品与试剂 大蒜素肠溶胶囊(20 mg/粒，湖北金龙福药业有限公司，批号H42022592)，D半乳糖由国药集团化学试剂有限公司提供(批号20050422)，兔抗P38 MAPK、SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒由武汉博士德有限公司提供，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒及超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

　　1.3 主要仪器 BX51 系统显微镜(Olympus)、微量进样器(上海安亭微量进样器厂)、UV3100PC型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。

　　1.4 动物分组及造模 按照改良的Morris法对60只小鼠进行连续7 d Morris水迷宫定向航行训练〔5〕。每天分上下午2个时段，每个时段训练2次，并记录小鼠从放入水槽至找到平台的时间(逃避潜伏期)，若120 s仍找不到平台，则由实验者将小鼠放置于平台上，逃避潜伏期记为120 s，并让小鼠在平台上休息30 s。根据训练成绩，选择成绩较好的30只小鼠。按体重分层随机分成3组： AD模型组，大蒜素治疗组，阴性对照组。每组10只。AD模型组与大蒜素治疗组皮下注射12.5% D半乳糖40 μl，连续60 d。

　　1.5 给药方法 大蒜素治疗组在造模的同时按10 ml/kg进行腹腔注射大蒜素肠溶胶囊提取物0.48 g·kg-1·d-1;AD模型组和阴性对照组给予相同剂量的生理盐水，连续60 d。

　　1.6 水迷宫行为学检测 连续给药60 d后，对小鼠进行改良的Morris水迷宫法检测，记录小鼠的逃避潜伏期，评价各组大鼠记忆能力的改变。

　　1.7 抗氧化活性检测 行为学检测结束后，用25%的乌拉坦麻醉小鼠后固定于自制的手术板上，置于解剖盘中，开胸暴露并游离心脏。切开右心房，经左心室插入灌流4℃生理盐水20～30 ml，直至肝脏颜色转白及右心房流出液澄清后，继续灌注4%甲醛20～30 ml，取脑组织海马部组织块1 cm3 左右，4%甲醛浸泡固定24 h后，做石蜡组织切片。测定残余脑组织重量，按重量体积比加4℃生理盐水制成10%的组织匀浆，离心(2 500 r/min，10 min)，取上清液，置4℃备用。测定SOD 活力和MDA 含量。

　　1.8 组织形态的观察 分别采用HE染色和铃木神经组织镀银改良法〔6〕染色观察小鼠海马神经细胞及神经原纤维缠结(NET)。

　　1.9 统计学方法 数据用x±s表示，两个样本比较采用t检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析，所有统计由SPSS17.0软件处理。

　　2 结 果

　　2.1 大蒜素AD模型小鼠学习记忆能力的影响 改良的Morris水迷宫记录小鼠的潜伏期，实验结果显示，AD模型组小鼠的潜伏期(54.25±4.34) s，明显长于大蒜素治疗组(6.67±1.81) s和阴性对照组(12.18±3.94) s，差异有统计学意义(P<0.05);大蒜素治疗组与阴性对照组潜伏期比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

　　2.2 MDA、SOD测定 大蒜素治疗组和阴性对照组MDA 含量较AD模型组显著降低(P<0.05)，SOD活性高于AD模型组(P<0.05)，见表1。

　　2.3 小鼠海马区域切片HE染色和铃木神经组织镀银改良法染色结果 HE染色结果显示，AD模型组海马区脑组织可见小胶质细胞增多，神经细胞数量减少，细胞散失，排列不成行，组织疏松;大蒜素治疗组海马区脑组织可见神经细胞普遍细长，细胞排列较规整;阴性对照组海马区脑组织神经细胞排列整齐，少数细胞浓染，见图1。铃木神经组织镀银改良法染色结果示，模型组海马区脑组织切片可清楚看到大量NET;大蒜素治疗组海马区脑组织切片锥体细胞显示清晰，均未见到NET;对照组海马区脑组织切片中锥体细胞显示清楚，形态正常，未见NET，见图2。表1 大蒜素对AD模型小鼠脑组织SOD活性和MDA 含量比较

　　3 讨 论

　　AD是发生在老年期或老年前期的一种中枢神经系统慢性渐行性退行性疾病，以脑细胞内NFT 、细胞外老年斑(SP) 以及大量神经元丢失为主要病理特征〔7〕。国内外研究证实，自由基引起的氧化损伤是不同病因诱发神经退行性疾病的共同通路〔8〕。大量的自由基能够损伤生物大分子使蛋白质、DNA和脂质过氧化，致使神经细胞凋亡和缺失，导致学习和记忆障碍，进而导致或加重AD。

　　大蒜素又名大蒜新素，化学名为二烯丙基三硫化物，其结构式为Ch3=CH-CH-S-S-S-Ch3-CH=Ch3，是大蒜的主要有效成分。藤田勋等〔〕研究表明大蒜素的抗氧化活性部位是S(O)SCh3CH=Ch3基团，其中烯丙基位的氢与抗氧化活性有关。有研究表明，大蒜素对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有明显保护作用〔9〕，其机制可能与提高抗氧化酶活性，抗脂质过氧化损伤及抗炎作用有关〔10〕。本研究表明大蒜素能改善AD模型小鼠学习能力和记忆功能，有效地清除脑组织过氧化代谢产物MDA，增强SOD的活性，提高了机体的抗氧化能力。因此，可以推断大蒜素可以用来早期干预或预防AD，改善AD患者认知、记忆等临床症状。

参考文献

1 邵力钧，单文卫.大蒜素的临床应用进展〔J〕.中国现代医生，2009;47(3)：453.

　　2 史载样，张久亮，毛建生.大蒜素注射液治疗急性脑梗死101例临床研究〔J〕.西医结合">中西医结合急救杂志，1999;6(9)：3904.

　　3 刘 浩，崔美芝，董 娟.大蒜素抗氧化延缓衰老作用的实验研究〔J〕.中国老年学杂志，2006;26(2)：2522.

　　4 郭莉华，李清君，胡玉燕，等.大蒜新素对脑缺血再灌注大鼠海马的保护作用及对P53蛋白表达的影响〔J〕.中国病理生理杂志，2009;25(2)：264.

　　5 聂荣庆，张 进，胡国柱，等.脑细胞活性因子对小鼠学习、记忆能力的影响〔J〕.中国行为医学科学，2002;11(5)：4882.

　　6 赖 红，田应燮.铃木神经组织镀银改良法在石蜡连续切片中的应用〔J〕.解剖科学进展，1995;1(4)：347.

　　7 St GeorgeHyslop PH，Petit A.Molecular biology and genetics of Alzheimer′s disease〔J〕.CR Biol，2005;328(2)：11930.

　　8 Yves C.Oxidative stress and Alzheimer disease〔J〕.Am J Clin Nutr，2000;71(2)：6219.

　　9 贾海忠，史载祥，李 格，等.大蒜素犬心肌缺血再灌注血流动力学影响〔J〕.中国中医基础医学杂志，2001;7(6)：413.

　　10 郑燕华，陈崇宏.大蒜素对大鼠急性脑缺血再灌注损伤保护作用的研究〔J〕.中国药理学通报，2004;20(7)：8213.