达肝素钠对兔血小板功能的影响及阿司匹林和氯吡格雷的干预作用

　　　　　　 作者：郑红梅 崔炜 杨颖 郝玉明 鲁静朝

　　　　　　 谷国强 谢瑞琴 杨晓红 郝杰 刘静 刘凡 都军

【摘要】 目的 研究达肝素钠对兔血小板活化的影响以及阿司匹林和氯吡格雷的干预。方法 纯种新西兰家兔12只，给予阿司匹林或氯吡格雷或二者合用喂饲，静脉注射达肝素钠前及注射后20、30 min检测ADP、AA诱导的血小板聚集、血浆CD62P和vWF的水平。结果 应用达肝素钠后血小板聚集、CD62及vWF无明显增加;与基线水平比较，阿司匹林组加用氯吡格雷两药合用，静脉注射达肝素钠前(9.50±4.18 vs 2.67±1.63)及注射后20 min(10.50±3.21 vs 2.83±1.66)ADP 诱导的血小板聚集均明显降低。单用阿司匹林喂饲7 d，应用达肝素钠后血小板聚集增加(7.00±4.10 vs 12.50±4.04)。结论 达肝素钠不会引起血小板激活;阿司匹林与达肝素钠合用增加血小板聚集;氯吡格雷与阿司匹林两药合用明显降低血小板聚集。

【关键词】 血小板活化;达肝素钠;阿司匹林;氯吡格雷

　　 目前，急性或慢性冠状动脉疾病及脑血管疾病治疗中抗栓药物已作为基础用药。抗栓药物依据其作用机制可分为三种：抗凝血药物、抗血小板药物、纤维蛋白溶解药物〔1〕。肝素是临床上最常使用的抗凝药物之一，但在肯定其抗凝疗效的同时，也有研究表明肝素既可抑制血小板功能，也可激活血小板〔2〕。低分子肝素是由肝素衍生而来，因其半衰期长，出血发生率低，无需实验室监测等优点已广泛应用于临床〔3〕。常用抗血小板药物包括阿司匹林，ADP受体拮抗剂及ⅡbⅢa受体拮抗剂，抗血小板治疗是缺血性心脏病治疗的基石。本研究同时研究了阿司匹林与氯吡格雷与达肝素钠共同应用对血小板功能的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与仪器 全血血小板聚集仪购自CHRONOLOG公司，型号为MODEL590。实验动物喂饲所用阿司匹林为阿司匹林泡腾片(巴米尔，500 mg/片)，购自阿斯利康制药有限公司;氯吡格雷(波立维，75 mg/片)购自赛诺菲制药有限公司;达肝素钠(法安明)由辉瑞比利时公司生产。CD62P、血管假性血友病因子(vWF)测定试剂盒购买自上海西塘生物技术公司，采用酶联免疫吸附双抗体夹心法定量测定。酶标仪为DENLEY DRAGON Wellscan MK3型，芬兰Thermo公司生产。

　　1.2 方法 纯种新西兰家兔12只，静脉注射达肝素钠200 IU/kg，注射前(0 min)及注射后20、30 min采血应用阻抗法检测二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)诱导的血小板聚集、血浆CD62P、vWF水平作为总的基线水平。然后随机分为阿司匹林组和氯吡格雷组。阿司匹林组首先给予阿司匹林(巴米尔 12 mg·kg-1·d-1)灌胃，连用7 d(第1～7天);而后与氯吡格雷(4 mg·kg-1·d-1)双药联合灌胃7 d(第7～14天)。氯吡格雷组首先予氯吡格雷(4 mg·kg-1·d-1)灌胃，连用7 d(第1～7天);而后和阿司匹林(巴米尔 12 mg·kg-1·d-1)双药联合灌胃7 d(第7～14天)。两组均分别在第7天和第14天静脉注射法安明(200 IU/L)，注射前(0 min)及注射后20、30 min应用全血阻抗法检测ADP、AA诱导的血小板聚集，同时留置血浆检测CD62P和vWF。

　　1.3 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析，计量资料用x±s表示。分析采用重复测量设计的方差分析。组间比较应用独立样本t检验。

　　2 结 果

　　2.1 抗凝药物对ADP、AA诱导的血小板聚集的影响 应用达肝素钠对ADP 诱导的血小板聚集无明显增加，注射达肝素钠20 min血小板聚集较注射前有所增加，30 min开始下降(8.08±4.50，8.83±3.95，8.50±5.48)，但差异无统计学意义。阿司匹林组加用氯吡格雷7 d后，静脉注射达肝素钠前及注射后20 min血小板聚集均较基线水平明显降低。阿司匹林基础上加用氯吡格雷与单用阿司匹林相比，血小板聚集亦明显降低。阿司匹林喂饲7 d后静脉注射达肝素钠后20 min较注射前血小板聚集明显升高。单用氯吡格雷喂饲后应用达肝素钠静脉注射前后及与基线水平比较均无明显变化。阿司匹林组和氯吡格雷组之间比较，给予阿司匹林或氯吡格雷前血小板聚集无统计学差异，但单用氯吡格雷给予低分子肝素钠静脉注射与单用阿司匹林给予达肝素钠静脉注射相比，前者血小板聚集明显偏低(3.83±2.23 vs 12.50±4.04)。尽管同为两药合用，最初先用阿司匹林组血小板聚集较先用氯吡咯雷组血小板聚集更低(2.67±1.63 vs 7.67±3.50)，见表1。

　　应用阿司匹林喂饲7 d，再次给予达肝素钠静脉注射后

　　30 min AA诱导的血小板聚集较注射前明显降低(15.17±3.87 vs 8.83±5.67)。余各组未见统计学差异，见表1。

　　2.2 抗凝药物对CD62P及vWF的影响 应用阿司匹林喂饲7 d给予低分子肝素静脉注射后30 min较20 min降低。给予阿司匹林或氯吡格雷或两药合用喂饲，与基线水平相比，CD62P水平均未见明显改变，vWF的检测均未见统计学差异，见表2。表1 阿司匹林或氯吡格雷及达肝素钠对ADP、AA诱导的血小板聚集(Ω)的影响与阿司匹林组基线比较：1)P<0.05;与阿司匹林用药7 d比较：2)P<0.05，3)P<0.01;与本组0 min比较：4)P<0.05，5)P<0.01;与阿司匹林+氯吡格雷比较：6)P<0.05表2 阿司匹林或氯吡格雷及达肝素钠对CD62P、vWF的影响与本组20 min比较：1)P<0.05

　　3 讨 论

　　肝素经化学或酶促反应解聚后而成为低分子肝素，其分子量在4 000～6 500 Da之间。有研究认为肝素对血小板的激活与其分子量有关〔4，5〕，随肝素分子量的增加，肝素与血小板的结合增加〔6〕。本研究显示，静脉注射达肝素钠后检测ADP、AA诱导的血小板聚集，20 min时呈现升高趋势，但无统计学意义，提示静脉注射低分子肝素钠后血小板聚集无明显改变。 CD62P属于黏附蛋白P选择素家族，主要位于血小板内α颗粒膜上，少部分存在内皮细胞WeibelPalade小体中，当血小板活化及内皮细胞受损伤刺激时，血小板膜表面及内皮细胞表面的CD62P表达明显增多，同时血浆可溶性CD629浓度也升高，是特异性的血小板活化的分子标志物〔7〕。因此，测定血浆中的CD62P浓度可反映血小板在体内活化的情况。肝素增加血小板和富含纤维蛋白凝血块的相互作用，增加心肺分流术病人CD62P水平〔8〕。在本研究中，应用达肝素钠静脉注射前后未发现CD62P浓度的改变。血小板的黏附和聚集形成血小板血栓，vWF主要由内皮细胞产生〔9〕，正常状态下，vWF与血小板并不结合，且数量不会增加。当内皮损伤时，vWF能够从内皮细胞释放到血浆或内皮下，通过GpIbIX受体调节血小板的粘附，可与GpⅡb/Ⅲa受体结合促进血小板聚集，也可保护Ⅷ因子避免其失活，促进凝血酶的产生〔10〕。本研究发现静脉注射达肝素钠后vWF呈下降趋势，但未发现有统计学意义。与以往报道的治疗剂量低分子肝素在体内、体外试验中均只显示微弱的激活血小板作用不相一致〔11〕。

　　在本项研究中，采用全血阻抗法检测血小板聚集。全血阻抗法与传统的光学比浊法相比存在许多优点，如不需标本的制备，减少了制备过程中的血小板活化、没有血细胞的丢失、维持血小板的真正数目等。血小板聚集率是目前获得检测血小板功能最有效的实验。

　　阿司匹林喂饲7 d，静脉注射达肝素钠后 AA 诱导的血小板聚集较注射前减低。 血小板膜磷脂在Ca2+依赖性的磷脂酶A2作用下释放花生四烯酸，后者先后经环氧合酶(COX1)及血栓烷合成酶的作用生成TXA2，导致血小板聚集。阿司匹林是一种COX1抑制剂，可通过抑制TXA2的产生而不可逆的抑制血小板聚集〔12〕。

　　ADP至少通过两个受体激活血小板〔13〕。ADP P2Y12受体途径通过Gi蛋白和AC耦联，AC催化ATP转化为cAMP，高水平的cAMP抑制血小板聚集，ADP结合到P2Y12受体切断AC途径，导致PI3K激活，加速血小板聚集和释放〔14〕。氯吡格雷是一种前体药物，它在肝脏的代谢物可以和P2Y12受体发生特异的不可逆的结合，切断这一途径而发挥抗血小板作用〔15〕，本研究同样显示氯吡格雷可降低ADP诱导的血小板聚集。ADP在止血过程中起到重要作用，不仅能刺激血小板引起聚集，而且当血小板活化后从致密颗粒分泌产生的ADP还可以增强其他因子引起的血小板聚集反应〔16〕。因此，任何减少ADP的行为都可以抑制血小板的进一步活化〔17〕。实质上，由其他诱导剂所致的ADP的释放增强了血小板的聚集，这一现象可解释为什么ADP受体拮抗剂可部分拮抗其他诱导剂所诱发的聚集〔18〕。

　　氯吡格雷通过不可逆的抑制与Gi蛋白耦联的ADP P2Y12受体而抑制血小板功能〔19〕，阿司匹林通过抑制TXA2的产生，间接抑制与Gq和G12/13蛋白耦联的TXA2受体结合的信号通路〔20〕，阿司匹林和氯吡格雷不同的信号途径使二者合用抗血小板作用相互补充。本研究显示，阿司匹林基础上加用氯吡格雷与基线水平相比显著降低ADP诱导的血小板聚集，与单独使用阿司匹林相比亦能明显降低血小板聚集。这一点与临床实验结果相一致，CURE研究中对12 562例病人的调查证实氯吡格雷加阿司匹林较单用阿司匹林在减少心血管事件方面更为优越，减少了急性冠脉综合征患者急性心梗、卒中和心血管死亡的发生率，高度建议阿司匹林和氯吡格雷联合使用〔21〕。

　　另外，本研究发现，单独给予阿司匹林喂饲7 d，给予低分子肝素静脉注射20 min后检测ADP诱导的血小板聚集，发现较注射前明显升高，而反观基线水平，未给予阿司匹林干预时，静脉注射达肝素钠无明显差异，这一结果显示阿司匹林与达肝素钠合用增强血小板ADP诱导的血小板聚集，提示阿司匹林是否增强肝素类药物的血小板激活作用。这一现象在合用氯吡格雷后消失，提示氯吡格雷拮抗二者所致血小板聚集的升高，同时也强烈暗示了临床上抗栓治疗过程中三者合用的必要性和重要性。

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