运动训练对老年痴呆小鼠的改善作用

　　　　　　 作者：赵燕燕 刘新霞 陈春生 田芳露 崔彦龙 仇鹏

【摘要】 目的 考察运动训练对老年痴呆小鼠学习记忆障碍的影响，并探讨其作用机制。方法 昆明种小鼠采用被动转笼法训练4 w后，采用Morris水迷宫法测试小鼠学习记忆能力;比色法检测脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量，HE染色观察海马组织形态学改变;BI2000图像分析系统测定小鼠微循环;采用耐缺氧实验观察小鼠耐缺氧能力。结果 与空白对照组比较，模型组小鼠定向游泳实验潜伏期显著延长(P< 0.05)，SOD活力显著降低，MDA含量显著升高(P<0.05)，海马神经元变性、脱落，耐缺氧存活时间显著延长;与模型组比较，运动训练对上述指标均有显著改善作用。与空白对照组比较，运动训练显著改善微循环、提高耐缺氧能力。结论 运动训练能不同程度地改善小鼠学习记忆障碍，其作用机制可能与运动能提高小鼠清除自由基能力、改善微循环、提高耐缺氧能力有关。

【关键词】 运动训练;学习记忆;自由基;组织形态学;微循环;耐缺氧

【Abstract】 Objective To investigate the effect of exercise on learning and memory impairment of senile dementia mice and explore its mechanism. Methods After 4 weeks of exercise with the running wheels， water maze task was used to evaluate the learning and memory function of mice. The activity of superoxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) were measured with colorimetry. The alterations in hippocampus slices morphology were assessed using microscope. The BI2000 image system was used to evaluate the microcirculation in mice′s ala auris. The survival time and persistent time of gasping were observed on acute anoxia mice. Results Compared with control group， the escape latency in directional swimming was prolonged， SOD activity was decreased and the content of MDA was increased in mice of model group. Compared with model group， exercise prolonged the escape latency， increased SOD activity and decreased the content of MDA and improved neurodegenerative changes and reduced the death of neuron in hippocampus slices and improved the microcirculation and enhanced the effect of antianoxia in mice. Conclusions Exercise can improve the learning and memory impairment in various degree. The mechanism may be related to improving the microcirculation and enhancing the effect of antianoxia and decreasing the free radical in mice.

　　【Key words】 Exercise; Learning and memory; Free radical; Morphology; Microcirculation; Antihypoxia

　　 随着社会人口的老龄化，老年痴呆的发病率逐年上升，老年痴呆的核心症状是记忆力、认知力等方面的障碍，不仅影响病人的生活质量，而且给家庭和社会带来沉重的负担。因其发病机制尚未完全阐明，临床尚缺乏理想的防治药物。大量研究表明，运动训练能增强机体免疫功能〔1〕、延缓衰老〔2〕，促进小鼠脑局灶缺血后功能恢复〔3〕。但运动训练对老年痴呆小鼠记忆能力的影响未见报道，本实验通过观察运动训练对学习记忆障碍小鼠学习记忆能力、耐缺氧能力、微循环的影响及脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量及海马组织形态学改变，来考察运动训练对学习记忆障碍小鼠学习记忆能力的影响，并探讨其作用机制，为进一步研究运动对老年痴呆的防治提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与仪器 尼莫地平(天津市中央药业有限公司，批号：070506);亚硝酸钠(北京双环试剂厂，批号：20070406)。SOD/MDA测试盒(南京建成生物技术研究所，批号：20070111/20070112)。小鼠Morris水迷宫装置及跟踪系统(成都泰盟公司产);X15R低温离心机(美国贝克曼有限公司);RM2135组织切片机(德国徕卡公司);BMJ1石蜡包埋机(天津航空机电公司);UV2550PC可见紫外分光光度计(日本岛津公司);CKX41倒置生物显微镜(日本奥林巴斯);BS244S电子分析天平(德国赛多利斯);转笼装置(河北大学医学实验中心自制)。

　　1.2 动物及分组 昆明种小鼠60只，体重31～35 g，12月龄，雌雄各半，由河北省实验动物中心提供，合格证号：DK0704128。将小鼠按体重随机分为6组，即空白对照组、模型组、尼莫地平组、高、中、低运动量组，每组10只。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 运动训练过程〔4〕 分别将高、中、低运动量组小鼠放进转速为9 r/min，直径为17 cm的带轴承转笼，让其被动跑笼。高运动量组小鼠第1天跑30 min，每天增加20 min，直至每天跑2 h;中运动量组小鼠第1天跑20 min，每天增加15 min，直至每天跑80 min，低运动量组小鼠第1天跑10 min，每天增加10 min，直至每天跑40 min。共训练6 w，每周跑5 d，周四、周日休息，每周日记录各组小鼠体重。空白对照组、模型组、尼莫地平组每次置于转笼中，但转笼不转动。第5周开始，尼莫地平组小鼠灌胃给予尼莫地平30 mg/kg，1次/d。所有运动训练均在动物暗周期6 pm～10 pm完成。

　　1.3.2 小鼠亚硝酸钠致记忆巩固障碍模型的制备 按文献方法〔5〕，每天在小鼠游泳训练后立即腹腔注射NaNO2 125 mg/kg，制作学习记忆巩固障碍模型。

　　1.3.3 小鼠水迷宫法〔5〕 实验装置主要由一只圆形水池、一个可移动位置的透明有机玻璃安全台和摄像机组成。圆池直径80 cm，高44 cm，安全台高20 cm，顶端圆形，直径为8 cm。水池分成均等的4个象限。按实验要求，可任意地将安全台设置于某一象限的中间。定向游泳实验的具体方法如下：安全台固定在4个象限中的任意一个位置不变。将小鼠头朝池壁轻轻地放入水中，让动物寻找安全台，小鼠爬上安全台后使其停留15 s，然后放入笼中。每天2次，共训练4 d，摄像机拍摄实验全过程，记录动物游泳轨迹，经软件分析计算动物总游泳时间和总轨迹长度。动物总游泳时间为逃避潜伏期，总轨迹长度为游泳路程。

　　1.3.4 小鼠脑组织中SOD、MDA的测定〔6〕 Morris水迷宫测试结束后，断头取大脑，用预冷生理盐水冲洗表面血液，滤纸擦干，取一半脑组织，以重量/体积比1∶9加入4℃生理盐水，制成10%的匀浆，3 000 r/min低温离心15 min，取上清液，按试剂盒说明，用可见紫外分光光度计测定大脑组织SOD活性及MDA含量，另一半脑组织留做石蜡切片。

　　1.3.5 小鼠脑组织石蜡切片的制备及HE染色 Morris水迷宫测试结束后，断头取大脑，用预冷生理盐水冲洗表面血液，滤纸擦干，取一半脑组织，10%甲醛溶液固定，常规石蜡切片，HE染色，显微镜下观察海马形态学改变。

　　1.3.6 小鼠耳廓微循环的测定〔7〕 取昆明种小鼠50只，体重31～35 g，12月龄，雌雄各半，按体重随机分为5组，即空白对照组、尼莫地平组、高运动量组、中运动量组、低运动量组，每组10只。训练方法同1.3.1。运动训练结束后，各组小鼠腹腔注射乌拉坦1 200 mg/kg麻醉后固定在小鼠观察台上。耳廓去毛(用透明胶带黏去)后，调节耳托高度，在耳廓表面滴加液体石蜡，使耳廓平展在耳托上。将观察台置于显微镜载物台上，调节冷光源至适当亮度，在透射光下，用100倍镜观察小鼠耳廓微循环情况。分别记录各鼠耳廓微动脉、微静脉血管管径及血流速度，以判断微循环改善情况。

　　1.3.7 小鼠急性脑缺血性缺氧实验〔8〕 取昆明种小鼠50只，体重31～35 g，12月龄，雌雄各半，动物分组及训练方法同1.3.6。运动训练结束后，用剪刀在小鼠双耳连线处快速断头，立即按秒表记录小鼠断头后至张口喘气停止时间，即小鼠张口呼吸时间。

　　1.3.8 小鼠亚硝酸钠模型常压耐缺氧实验〔8〕 取昆明种小鼠60只，体重31～35 g，12月龄，雌雄各半，动物分组及训练方法同1.3.1。运动训练结束后，除空白对照组外，其余各组小鼠均腹腔注射亚硝酸钠125 mg/kg，制备缺氧模型，5 min后，将小鼠逐只放进盛有10 g钠石灰的250 ml密闭广口瓶中，记录每只小鼠存活时间。

　　1.4 统计学处理 实验数据用x±s表示。采用SPSS11.0软件进行方差分析和t检验。

　　2 结 果

　　2.1 运动训练对记忆巩固障碍小鼠潜伏期的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠，第3、4、5、7次训练逃避潜伏期均显著延长(P<0.05)。与模型组比较，高运动量组小鼠第3、4、7次训练的逃避潜伏期均显著缩短(P<0.05)，中运动量组小鼠第4、5次训练的逃避潜伏期均显著缩短(P<0.05);低运动量组小鼠第4次训练的逃避潜伏期显著缩短(P<0.05);各组小鼠在其他次数训练时，逃避潜伏期均有缩短趋势，但差异无统计学意义(P﹥0.05)。实验结果表明，运动训练能显著缩短亚硝酸钠致记忆巩固障碍模型小鼠Morris水迷宫定向游泳实验潜伏期，改善亚硝酸钠致记忆巩固障碍模型小鼠空间学习记忆能力。见图1。

　　与空白对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与模型对照组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

　　图1 运动训练对亚硝酸钠致记忆巩固障碍模型小鼠

　　Morris水迷宫潜伏期的影响(x±s，n=10)2.2 运动训练对记忆巩固障碍小鼠脑组织SOD、MDA的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠脑组织中SOD活力显著降低(P<0.01)，MDA含量显著升高(P<0.01);与模型组比较，尼莫地平组、高、中、低运动量组小鼠脑组织中SOD活力均显著升高(P<0.05，P<0.01)，MDA含量显著降低(P<0.05，P<0.01)。表明运动训练能显著提高亚硝酸钠致记忆巩固障碍模型小鼠脑组织中SOD活力，降低MDA含量，提高小鼠清除自由基的能力。见表1。表1 运动训练对记忆巩固障碍小鼠脑组织SOD和MDA的影响与空白对照组比较：1)P<0.01;与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01

　　2.3 运动训练对记忆巩固障碍小鼠海马组织形态的影响 与空白对照组比较，模型组海马CA3区神经细胞变性坏死，表现为轴突消失、胞浆深染、空泡样变，核固缩、胞膜核膜界限不清。

　　高、中、低运动量训练不同程度改善了CA3区神经细胞病理改变。表明运动训练能改善亚硝酸钠致记忆巩固障碍模型小鼠海马组织形态的损害。见图2。

　　2.4 运动训练对记忆巩固障碍小鼠常压耐缺氧的影响 与空白对照组小鼠存活时间〔(54.8±16.1) min〕比较，模型组〔(89.0±13.7) min〕显著延长(P<0.01);与模型对照组比较，尼莫地平组、高、低运动量组小鼠存活时间均显著缩短〔分别为(42.8±15.6)、(68.2±12.5)、(57.3±30.0)、(62.5±15.4) min〕(P<0.01，P<0.05)，中运动量组小鼠存活时间有缩短趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。表明运动训练能显著缩短亚硝酸钠模型小鼠常压耐缺氧存活时间。

　　2.5 运动训练对小鼠急性脑缺血缺氧实验的影响 空白对照组小鼠断头后张口呼吸时间为(14.0±1.4) min，尼莫地平组、高、中、低运动量组均显著延长〔分别为(17.0±0.8)、(18.5±3.0)、(19.0±2.2)和(17.25±2.2) min〕(P<0.05)。表明运动训练能显著延长断头小鼠张口呼吸时间。

　　2.6 运动训练对小鼠耳廓微循环的影响 与空白对照组比较，尼莫地平组小鼠微动脉、静脉流速显著增加(P<0.05)，高运动量组小鼠耳廓微动脉、微静脉流速均显著增加，微动脉管径均显著增加(P<0.05);中运动量组小鼠耳廓微动脉管径均显著增加(P<0.01);低运动量组小鼠耳廓微动脉流速及微动脉管径均显著增加(P<0.05);结果表明，运动训练能显著增加微动脉、微静脉血流速度，增加微动脉管径，改善微循环。见表2。图2 运动训练对亚硝酸钠致记忆巩固障碍模型小鼠海马组织形态的影响(HE染色，100个)表2 运动训练对小鼠耳廓微循环的影响　与空白对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

　　3 讨 论

　　3.1 运动方式的选择及运动量的确定 研究表明，合理安排的运动训练能够促进新陈代谢，增强活力，改善心血管功能，促进学习记忆〔5〕。运动训练对机体影响的研究常选用小鼠或大鼠。小鼠运动方式有3种:①平板跑台运动;②小鼠游泳运动;③跑转笼运动。每种运动方式既有优点又有相对的不足，被动跑笼训练，可以训练小鼠抓握和行走能力，模拟人的跑步运动，还可避免平板跑台运动造成的应激反应。所以该实验采用小鼠被动跑转笼法对小鼠进行运动训练。

　　本实验参考Fordyce等人研究运动对小鼠海马的影响时观察到小鼠的平均跑速为9～13 m/min〔9〕，陈运才等研究不同年龄小鼠主动跑转轮的运动量的变化显示5月龄小鼠每周约跑4 500圈(直径为17 cm的转笼)〔10〕，确定运动量。

　　3.2 记忆巩固障碍小鼠模型的制备 一次性腹腔注射亚硝酸钠120 mg/kg是制造小鼠记忆巩固障碍模型的常用方法〔11〕，亚硝酸钠大量进入机体后，可使正常的血红蛋白变为高铁血红蛋白，失去携氧功能，引起组织缺氧〔12〕，我们根据实验条件加大亚硝酸钠剂量(125 mg/kg)，可引起记忆巩固障碍。

　　3.3 运动训练对记忆巩固障碍模型小鼠自由基清除能力的影响 正常情况下，机体存在一个自由基清除系统，其中包括SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽 (GSH) 及谷胱甘肽过氧化酶 (GSHPx)、维生素E等。在脑内最重要的预防机制是SOD、GSH系统，SOD能使O-2进一步生成h3O2，在GSHPx的作用下可使h3O2分解成水。当两者减少或活力低下时，自由基被清除减少，数量相对增多，导致生物膜受损，自由基脂质过氧化。自由基脂质过氧化(LPO)是多不饱和脂肪酸受自由基作用后形成的，MDA是LPO的代谢产物，其含量可反映脂质过氧化程度〔13〕。本实验结果表明，适宜的运动训练能提高学习记忆障碍小鼠空间学习记忆能力，其作用机制可能与提高小鼠脑内自由基清除能力有关。

　　3.4 海马与学习记忆的关系 海马结构是学习记忆的重要部位，其中，海马区对缺氧缺血特别敏感，海马区被认为与学习记忆密切相关〔14〕。本实验证实海马神经元结构的复杂变化与学习记忆密切相关。

　　3.5 运动训练对亚硝酸钠模型小鼠常压耐缺氧能力的影响 亚硝酸钠大量进入机体后，可使正常的血红蛋白变为高铁血红蛋白，使其失去携氧功能，造成组织缺氧〔12〕，将小鼠放在密闭容器中，使其进一步受缺氧因素损害。本实验结果显示，模型对照组小鼠存活时间显著延长，尼莫地平组和高、低运动量组小鼠存活时间均显著缩短。这可能是与注射亚硝酸钠后，造成机体组织缺氧，模型组小鼠对缺氧已经适应，较耐受缺氧状态，所以存活时间较长;而尼莫地平与运动均能对抗亚硝酸钠的致缺氧作用，反而使小鼠不能耐受密闭缺氧，所以存活时间较短。

　　3.6 运动训练对小鼠耳廓微循环及耐急性缺血性缺氧能力的影响 机体各部位尤其是脑组织的供血不足，导致神经元代谢下降，进而可引起脑老化、甚至痴呆。国内外已有脑血流量降低度与痴呆的严重程度成正比的报道〔15〕。本实验表明，运动能增加微动脉管径，增加微动、微静脉血流速度，从而改善微循环，增加组织器官的血流量，延长小鼠断头呼吸持续时间，这可能与运动训练提高学习记忆障碍小鼠空间学习记忆能力有关。

　　综上所述，运动训练能提高亚硝酸钠致记忆巩固障碍模型小鼠空间学习记忆能力，对老年痴呆的学习记忆障碍有改善作用，其作用机制可能与提高机体自由基清除能力，降低自由基水平，扩张微血管改善微循环，增加组织器官的血流量及提高机体耐缺氧能力有关。

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