移植入阿尔茨海默病大鼠海马内神经干细胞的存活、迁移和分化

　　　　　　作者：杨春 白琳琳 王书春 乔鹏 章茜

【摘要】 目的 观察新生大鼠海马齿状回的神经干细胞(NSCs)移植到阿尔茨海默病(AD)模型大鼠海马内的存活、迁移和分化。方法 将Hoechst33258标记的NSCs植入AD模型大鼠海马，移植2、4和6 w后，行Y迷宫检测大鼠的学习记忆能力，结合Hoechst33258标记和荧光免疫组化技术，分析NSCs在AD大鼠海马中的存活、迁移和分化。结果 移植的NSCs在宿主脑内能够存活至少6 w，沿海马回向两侧迁移，NSCs移植2 w后，免疫荧光检测无明显神经丝蛋白200(NF200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、谷氨酸(Glu)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)阳性反应，而移植后4、6 w，则可见免疫阳性反应细胞。Y迷宫测试结果显示移植NSCs 2、4、6 w后大鼠学习、记忆能力明显得到恢复，与AD模型组比较有统计学意义（P<0.05)，与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05)。结论 自新生大鼠海马齿状回分离培养的NSCs在AD模型大鼠海马内能够存活、迁移并分化为胆碱能、谷氨酸能神经元及神经胶质细胞。

【关键词】 阿尔茨海默病；神经干细胞；移植；分化

　　阿尔茨海默病(AD)是中枢神经退行性疾病之一，现已成为严重威胁老年人健康的四大疾病之一。有研究表明前脑胆碱能投射系统胆碱能神经元变性、细胞数量减少，导致AD认知功能不可逆的减退〔1〕。目前药物治疗效果不理想，因此寻找有效的治疗方法已迫在眉睫，而神经干细胞(NSCs)的自我更新和多分化潜能等特性使得NSCs移植成为一个较理想的治疗策略。我们之前的研究已观察到NSCs移植到AD大鼠海马内能够存活、增殖〔2〕，但能否分化为神经元尚不清楚。因此本研究将进一步观察移植的NSCs在AD模型大鼠脑内的分化，即是否能分化为神经元，特别是胆碱能和谷氨酸（Glu)能神经元，为临床治疗AD提供新思路和可借鉴的动物实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物及分组

　　健康雄性SD大鼠（3～4月龄，体重250～300 g)、新生SD大鼠(24 h内)，均为郑州大学医学院实验动物中心提供。取成功AD模型大鼠32只，分为AD模型组、模型后2、4、6 w移植组，另设正常对照组，每组各8只。

　　1.1.2 主要试剂和仪器

　　β淀粉样蛋白140（Aβ140)、Hoechst33258、 DAB试剂盒、神经丝蛋白200(NF200)抗体 (Sigma公司)， DMEM/F12、B27（Gibco公司)，表皮细胞生长因子（EGF)(珠海京美生物公司)，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)（北京邦定生物公司)，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、胆碱乙酰转移酶 (ChAT)抗体、TRITC标记抗小鼠IgG、TRITC标记抗兔IgG（北京中杉公司)，Glu 抗体（武汉博士德公司)。SP试剂盒(北京中山生物技术有限公司)；Y型电迷宫（张家港生物医学仪器厂)、荧光显微镜（日本尼康E600)、大鼠立体定向仪SN2型（日本东京成茂科学器械研究所)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 AD模型制备

　　Aβ140溶于无菌生理盐水(2 μg/μl)，用前37℃孵育1 w以上，使其变为聚集状态的Aβ。AD模型组及移植组大鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉（3 ml/kg体重)，参照Paxinos大鼠图谱〔3〕，选择双侧海马CA1区为注射靶区，详见

参考文献

〔2〕。

　　1.2.2 海马NSCs的分离培养

　　见

参考文献

〔2〕。

　　1.2.3 海马NSCs移植

　　AD模型组、移植组大鼠先制备成AD模型。模型建立7 d后，收集第2代培养的NSCs用Hoechst33258 (10 μg /ml培养液)标记30 min。将细胞反复吹打使之分散，活细胞计数，离心调整细胞浓度为1×105个/μl；然后以制备AD模型同样的方法、同样的位点分别将5 μl细胞悬液注入2、4和6 w移植组大鼠海马CA1区。AD组则以同样的方法、同样的位点注入等量无菌生理盐水。正常对照组不施以任何处理。动物按照上述分组，正常对照组、AD模型组于移植2 w后分别进行行为学检测，各移植组分别于移植2、4、6 w后进行行为学检测和荧光免疫组织化学染色。

　　1.2.4 AD大鼠行为学检测〔2〕

　　采用Y型电迷宫。①学习能力测试：以大鼠受电击后从起步区直接逃至安全区为正确反应，以连续10次中有9次（9/10)正确反应前所需的电击次数（即尝试次数)表示其学习获得能力。②记忆再现测试：上述达标大鼠休息24 h后，同法检测其记忆力。以达9/10标准前的尝试次数表示记忆再现能力。

　　1.2.5 荧光免疫组织化学染色

　　迷宫实验结束后各组大鼠快速取脑，常规固定，冠状冰冻切片，片厚30 μm，行荧光免疫组织化学染色。取相邻海马脑切片，4℃丙酮固定10 min，风干； 0.3％ h3O2室温10 min； 0.125％胰酶消化15 min；2％正常山羊血清封闭，室温孵育15 min；滴加一抗（抗NF200抗体，1∶400；抗GFAP抗体，1∶50；抗Glu抗体，1∶200；抗ChAT抗体，1∶400)，4℃孵育24 h；滴加1∶50稀释的TRITC标记IgG，37℃孵育40 min。甘油缓冲液封片。0.02 mol/L PBS做阴性对照。

　　1.3 统计学处理

　　全部数据以x±s表示，应用SPSS10.0统计软件包行单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 移植细胞的存活和迁移

　　2、4、6 w脑片在荧光显微镜下Hoechst33258标记的移植细胞呈黄绿色荧光，细胞大多呈圆形，大小不一。移植后2 w，黄绿色荧光亮点迁移较明显，除移植位点和针道内有密集黄绿色亮点或团块外，部分细胞沿海马回向两侧迁移，并排列成黄绿色条带状。迁移距离随时间而增加，移植2、4、6 w后分别可达2、3、4 mm。移植后6 w，迁移细胞在海马回内，向内侧接近第三脑室，向外侧达到侧脑室上方。

　　2.2 移植细胞的分化

　　NSCs移植2 w后，免疫荧光检测无明显NF200、GFAP、Glu、ChAT阳性反应，而移植后4、6 w，则可见免疫阳性反应。Hoechst33258/GFAP双标阳性细胞，主要位于大脑皮层，胞体中央有一个大而圆的核，胞浆少，并可见多个较长的突起（图1)，表明细胞形态已发育成熟。Hoechst33258/NF200双标阳性细胞，主要位于移植细胞的周边部位，其双标阳性细胞的形态已为成熟神经元，表现为胞体中央有一个大而圆的核，胞浆少，细胞膜发起突起，明显可见延伸较长的轴突（图1)。同样，在移植后4、6 w也可见到少量Hoechst33258/Glu双标阳性细胞及Hoechst33258/ChAT双标阳性细胞。前者表型为胞核大，胞浆少，为圆形或椭圆形（图1)；后者表现与前者相似，偶有纤维突起（图1)。

　　2.3 行为学测试

　　正常对照组、AD模型组、2、4和6 w移植组学习获得尝试次数分别为34.83±7.59、98.17±1.83、39.50±3.62、38.33±5.87、37.17±5.91；记忆获得尝试次数分别为18.33±4.18、77.17±8.00、21.50±3.49、20.50±4.62、20.33±4.91。结果显示注射Aβ140后，大鼠迷宫学习、记忆能力显著下降（P<0.05)。移植NSCs 2、4、6 w后大鼠学习、记忆能力明显得到恢复，与AD模型组比较有统计学意义（P<0.05)，与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05)。移植后各组间学习、记忆能力差异无统计学意义（P＞0.05)。

　　3 讨论
　　
　　本研究表明自新生大鼠海马齿状回分离培养的NSCs在AD大鼠脑内能够存活至少6 w，沿海马回向两侧迁移，并能分化形成神经胶质细胞和神经元，特别是胆碱能、Glu能神经元，有效改善AD模型鼠的学习、记忆能力。对移植的NSCs进行预先标记，以便于了解移植后其存活、迁移和分化情况。本实验选用的Hoechst33258属于Bisbenzimid类的活细胞荧光色素，仅能与双链DNA结合，而对细胞没有太大的细胞毒作用。已有研究发现前脑室下带的NSCs可以通过吻侧迁移流（rostral migration stream，RMS)迁移至嗅球〔4〕。因此，提出神经细胞是沿着胶质细胞的纤维迁移的假说。之后的体外细胞实验中观察到神经细胞沿着辐射状排列的胶质细胞进行迁移〔5〕，证实了这种迁移运动的存在。此外，部分脑区对神经细胞有排斥作用〔6〕，在本实验中，移植的NSCs，沿着海马回固有通道向两侧迁移，并未表现明显的导向性，与NSCs沿着胶质细胞的纤维迁移的理论有共通之处。根据正切迁移的假说，推测本实验中NSCs的迁移也可能受到海马或大脑皮层细胞的排斥，导致其沿着海马回双向迁移。在迁移过程中，NSCs是否受到某些物质的诱导，这种诱导作用受哪些因素的调控，目前仍不明确。
　　
　　中枢乙酰胆碱在学习记忆过程中起着非常重要的作用。海马接受丰富的胆碱能神经支配，其胆碱能纤维末梢与海马锥体细胞和颗粒细胞树突密切联系〔7〕。胆碱能神经元退变是AD重要的神经病理特征，而且胆碱能退变的程度与痴呆的程度相一致〔1〕。本实验结果还显示部分移植的NSCs表达了GFAP和NF200。GFAP和NF200是目前公认的神经胶质细胞和神经元的特异性标志物。本研究结果表明有部分移植的NSCs在AD大鼠海马内可分化为神经元和胶质细胞，进一步的结果表明NSCs可以分化为胆碱能神经元和Glu能神经元。结合行为学测试结果，推测移植后NSCs分化成胆碱能神经元，能与宿主功能整合，部分重建神经网络，替代AD病程中丢失的细胞，对大鼠学习、记忆能力的改善起到了重要的作用。
　　
　　海马结构中分布最广泛的兴奋性氨基酸是Glu。Glu激活NMDA受体引起的兴奋性传递在长时程增强（LTP)形成中起关键性作用。而LTP是中枢神经系统突触可塑性的一种模式，是学习和记忆的神经基础〔8〕。本实验结果表明，移植的NSCs可以分化为Glu能神经元，可能对AD大鼠学习、记忆能力的恢复起到一定作用。但是如何使移植的NSCs有更高的存活率，使NSCs能更有效地发生定向分化，AD病理微环境对移植NSCs的影响尚有待于进一步的研究。

参考文献

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　　2 杨 春，章 茜，王书春，等.AD大鼠海马内植入神经干细胞后效果观察〔J〕.中国应用生理学杂志，2007;23（2)：15961.

　　3 Paxinos G，Waston C.The rat brain in stereotaxic coordinates〔M〕.4th ed.New York：Academic Press Inc，1998:33.

　　4 MendozaTorreblanca JG，MartínezMartínez E，TapiaRodríguez M，et al.The rostral migratory stream is a neurogenic niche that predominantly engenders periglomerular cells：in vivo evidence in the adult rat brain〔J〕. Neurosci Res，2008;60(3):28999.

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