地尔硫艹卓、N乙酰半胱氨酸和过氧化氢酶联合应用对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用

【摘要】 目的 探讨地尔硫艹卓、N乙酰半胱氨酸（NAC）和过氧化氢酶（CAT）联合应用对兔脊髓缺血再灌注（I/R）损伤的保护作用。方法 阻断肾下腹主动脉及髂动脉建立兔脊髓I/R损伤模型，治疗组经阻断动脉灌注地尔硫艹卓、NAC和CAT混合盐溶液，检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx），观察实验兔行为学变化及损伤病理变化，并与单纯手术组作对照。结果 治疗组SOD和GPx活性高于对照组，而MDA水平低于对照组(P<0.05)。病理学检查发现脊髓出血和神经细胞破坏治疗组较对照组轻。治疗组神经行为学评分优于对照组(P<0.01)。 结论 在脊髓缺血后应用地尔硫艹卓、NAC和GPx的混合盐溶液可以有效减少脊髓I/R损伤造成的损害。

【关键词】 脊髓缺血；截瘫；缺血再灌注损伤；主动脉阻断

　　脊髓损伤(SCI)是一种严重中枢神经系统损伤。其病因包括脊柱骨折脱位，锐器伤或火器伤，以及主动脉、脊柱或盆腔等部位的手术中因阻断脊髓供血动脉所致的缺血再灌注（I/R）损伤。据报道胸主或胸腹主动脉瘤术后截瘫的发生率高达6%～40%〔1，2〕，尽管国内外学者已采用如脑脊液引流、左心转流、血管移植转流及深低温停循环等多种措施保护脊髓，但仍无法完全避免术后截瘫的发生〔3，4〕。因此，脊髓I/R损伤的药物保护措施成为众多学者的研究重点。研究发现过氧化氢酶（CAT）、N乙酰半胱氨酸（NAC）在脊髓I/R损伤中均能起到保护作用〔5，6〕，但钙离子通道阻滞剂地尔硫艹卓在这方面的研究报道并不多见。本研究旨在探讨地尔硫艹卓、NAC及CAT联合应用对脊髓I/R损伤方面的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　实验动物为国产雄性大耳实验兔20只（由解放军第208医院实验动物中心提供），兔龄8个月，体重2.2～3.8 kg（平均2.9 kg），随机分为2组，每组10只。仪器与试剂：紫外分光光度计（SHIMADZU岛津UVmini1240），无损伤血管夹，咬骨钳，电子体温计（欧姆龙 MC142L），丙二醛(MDA)检测试剂盒（S0131）、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)检测试剂盒（S0056）、超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（S0060）均购自碧云天生物技术研究所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 术前准备

　　术前8 h禁食，初始镇静采用盐酸塞拉嗪注射液（4 mg/kg）。5 min后，用氯胺酮（40 mg/kg）肌注维持麻醉。动物置于电热毯加热的手术台上防止体温过低，持续直肠测温，体温维持在37.5℃～38.5℃，术中耳缘静脉建立通路。手术开始前输入生理盐水20 ml(稀释青霉素80万U)，继而输入乳酸林格氏液，根据情况调整输液速度维持血容量。

　　1.2.2 动物模型的建立

　　动物右侧卧于手术台上，无菌条件下取左竖脊肌外侧缘直切口，腹膜后间隙钝性分离并显露腹主动脉、左肾动脉。耳缘静脉注射肝素钠（150 U/kg），3 min后，首先夹闭远端腹主动脉，然后用血管夹阻断左肾动脉开口下方0.5 cm处腹主动脉。对照组动脉阻断30 min，治疗组动脉阻断30 min并经两个血管夹之间动脉灌注地尔硫艹卓（0.25 mg/kg）、CAT（10 000 U/kg）、NAC（50 mg/kg）氯化钠溶液(6 ml/kg)。两组均30 min后松开血管夹（松夹时间3 s）对脊髓进行再灌注，并静点硫酸鱼精蛋白（1 mg/kg）以拮抗肝素的作用。动脉灌注部位以70无创线缝合，皮肤以30丝线缝合。

　　1.2.3 行为学观察评分

　　再灌注48 h后采用Tarlov评分标准对下肢行为进行评估〔7〕。0级：后肢无活动，不能负重；Ⅰ级：后肢可见活动，但不能负重；Ⅱ级：后肢活动频繁或有力，不能负重；Ⅲ级：后肢可支持体重，能走1～2步；Ⅳ级：可行走，仅有轻度障碍；Ⅴ级：行走正常。

　　1.2.4 标本采集及处理

　　再灌注48 h，全麻状态下取俯卧位，后正中切口，逐层剥离椎旁肌，暴露出各段棘突，以咬骨钳咬断棘突和椎板，暴露至脊髓硬膜，分离并取出脊髓L3～L6节段。

　　1.2.5 病理学检查

　　取L5～L6脊髓石蜡包埋、制片。通过HE染色，观察脊髓内出血及神经细胞破坏情况。

　　1.2.6 生化指标测定

　　取L3～L4脊髓分别存储于-80℃冰箱中，检测前每份组织中加入三羟甲基氨基甲烷10 ml，每1 g脊髓组织匀浆化后以5 200 r/min，4℃离心10 min。分别取上清液存储于-80℃冰箱中，采用TBA法测定MDA含量，黄嘌呤过氧化物酶法测定SOD活性，操作步骤均参照各试剂盒说明书。

　　1.3 统计学分析

　　用SPSS13.0数据统计软件，均数采用t检验。两组间采用以下参数对比：Tarlov评分、SOD活性、GPx活性、MDA含量。

　　2 结果

　　2.1 行为学观察评分结果

　　对照组6只实验兔评分为0，3只1分，1只3分；治疗组没有实验兔完全瘫痪，其中1只评分为5分，1只4分，5只3分，3只2分。治疗组神经功能明显优于对照组（P<0.01）。

　　2.2 病理学检查结果

　　组织病理学分析脊髓片段，脊髓内出血及神经细胞坏死情况光镜下评分对照组1只1分，4只2分，5只3分；治疗组3只1分，6只2分，1只3分，对照组病理改变的程度大于治疗组（P<0.05）。

　　2.3 生化指标测试结果

　　治疗组动物脊髓样本中SOD、GPx水平较高（P<0.05），MDA作为脂质过氧化反应的指标在治疗组明显降低（P<0.05）。表1 再灌注48 h脊髓组织MDA含量和SOD、GPx活性（略)

　　3 讨论
　　
　　脊髓I/R损伤通常都以家兔、犬及灵长类实验动物作为研究对象。犬和灵长类动物由于脊髓血供源自T7～T12水平，必需开胸完成主动脉的阻断才能建立脊髓缺血模型。而家兔因其血供分支源自远侧腹主动脉，阻断腹主动脉即可使腰段脊髓缺血。因此家兔是研究脊髓I/R损伤的首选实验动物。而经背侧腹膜后间隙分离显露腹主动脉阻断法因其易操作、创伤小，避免了内脏在空气中的长期暴露，因此本文采用这种手术方法建立I/R损伤模型〔8〕。腹主动脉阻断不会使脊髓完全缺血，在肾下腹主血管夹闭21 min后仍有2%血流通过侧支循环供应脊髓〔9〕，这些侧支循环存在个体差异，为此笔者应用第2个血管夹阻断髂动脉侧支循环。低温是保护脊髓I/R损伤的一种有效的措施，为避免低温对实验数据的影响，术中用电加热垫维持实验动物术中体温。
　　
　　很多研究探讨了多种药物，如钙离子通道阻滞剂及抗氧化剂在防止脊髓I/R损伤中的作用。由于平滑肌纤维收缩或者舒张需要钙离子的参与，地尔硫艹卓作为钙离子通道阻滞剂，阻滞钙离子通过细胞膜进入细胞，从而使血管平滑肌扩张和心肌舒张，进而使末端血流及侧支循环血流增加〔10〕；过氧化氢酶能防止在过氧化氢分解成氧和水的过程中形成有毒的自由基〔11〕；NAC有黏液溶解和抗氧化作用，能通过组织氧化获得氧气，保护脊髓局部免于再灌注损伤〔12〕。有报道显示，在不同的I/R模型中，应用抗氧化剂可以有效保护脊髓，而NAC由于对人体有很好的耐受性和较小的副作用，因此将其作为抗氧化剂的首选。但是，使用单一药物是不够的，必须联合应用，并结合手术方法的改进才能达到防止脊髓损伤的预期结果〔6，13，14〕，因此，笔者将地尔硫艹卓、NAC、CAT联合应用，探讨其混合盐溶液在脊髓I/R损伤中的保护作用。
　　
　　MDA是脂质过氧化反应的代谢产物，可以代表脂质过氧化反应的水平，由于在脊髓缺血损伤后显著增加，因此可以作为评估再灌注损伤的指标。Belboul等〔15〕研究发现，冠状动脉手术患者MDA在再灌注30 min后增加。本研究中，对照组MDA的增加明显高于治疗组。
　　
　　SOD在防止过氧化反应性损伤、保护细胞方面发挥重要角色，抑制脂质过氧化反应使细胞内超氧化活动降低。如果缺血维持较长时间，SOD活动就会下降，因为其寿命很短。许多作者都报道过组织SOD活性在应用药物治疗I/R损伤组明显增加。本实验中SOD水平在应用抗氧化物因子组也是明显增加的。GPx催化h3O2和脂质过氧化酶，保护细胞膜损伤，阻止脂质过氧化反应的开始和发展。林丽娜等〔16〕在脊髓缺血再灌注损伤研究中检测抗氧化酶活力，发现川芎嗪组GPx活性明显高于对照组，本研究中治疗组GPx水平也明显增加。脊髓内出血及神经细胞的破坏常作为神经功能不良预后的证据，本研究中治疗组病理学分析脊髓切片显示脊髓内出血及神经细胞破坏程度明显低于对照组。
　　
　　综上所述，联合应用NCA、CAT及地尔硫艹卓，虽不能完全防止脊髓缺血损伤，但是作为动脉手术中预防脊髓I/R损伤的一种重要手段，其效果是不容忽视的。

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