缺氧诱导因子α亚型基因在争性心肌梗死大鼠缺血心肌的表达变化

　　　　　　 作者：张萍 赵晓云 邢邯英 李小慧 王红艳

【摘要】 目的 通过观察急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌缺氧诱导因子 (hypoiainducible factor，HIF) 3个α亚型mRNA表达的动态变化，探讨其在早期缺血心肌中的作用。方法 将大鼠随机分为对照组和AMI组。用HE染色观察心肌形态学变化， RTPCR检测术后1、2、4、6、12 h缺血心肌HIF 3个α亚型mRNA表达情况。结果 HIF1α、2α、3α mRNA在正常心肌中均有表达。术后1 h，缺血心肌HIF1α mRNA表达明显上调（P<0.05)，2 h达高峰（P<0.01)，4 h开始下降（P＜0.05)，6 h降至正常水平，12 h维持在正常水平；HIF2α、3α mRNA在急性缺血心肌表达无明显变化。结论 早期急性心肌缺血可诱导HIF1α基因表达改变，与HIF2α、3α基因表达无关。

【关键词】 心肌梗死；缺氧诱导因子α；缺血心肌

　　缺氧诱导因子1(HIF1)由α 和β 亚基以异源二聚体形式组成，参与对低氧反应信号的转导过程，其中HIFα(HIF1α，2α和3α)是HIF的功能亚基，具有生物活性，是唯一可接受氧浓度变化调控的亚单位，决定着HIF的活性。近年研究认为HIF1α 是缺血性心脏病发病过程中的关键性调控因子，在低氧应答反应中起关键作用。本研究拟通过观察HIF1α、HIF2α 和HIF3α mRNA在缺血心肌表达的动态变化，探讨其在早期缺血心肌中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　选择清洁级雄性成年SD大鼠36只，体重250～300 g，由河北医科大学动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK(冀)20031003。逆转录酶（AMVRT)和Taq DNA聚合酶购自美国Promega 公司；HIFα及βactin引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2 分组

　　将大鼠随机分为对照组：未作任何处理和急性心肌梗死（AMI)组。大鼠称重后用3%戊巴比妥钠（35 mg/kg)腹腔注射，麻醉后仰位固定，记录标准6导联心电图。气管插管，接小动物呼吸机。沿大鼠左侧第三、四肋间作一纵切口约1 cm，逐层打开胸壁至胸腔内，小心撕开心包，将心脏轻轻挤出后，在左心耳与肺动脉圆锥之间平左心耳下缘约3 cm处结扎冠状动脉左前降支，术毕逐层关胸。大鼠有自主呼吸后拔除气管内插管。以结扎线以下心肌颜色变暗及结扎冠脉20 min内心电图ST段、T波进行性抬高为成功结扎的指标。对照组大鼠于麻醉后处死；AMI组于术后1、2、4、6、12 h麻醉处死。

　　1.3 检测指标

　　1.3.1 心肌组织形态学观察

　　将大鼠新鲜心肌组织按石蜡切片制作、切片脱蜡至水，行HE染色。

　　1.3.2 HIFα 基因表达

　　取大鼠左心室心肌组织，Trizol一步法提取总RNA，反转录后行HIF1α、HIF2α、HIF3α和内参照βactin基因的PCR扩增。参照Genbank资料及文献〔1，2〕设计引物，RTPCR反应引物对序列及扩增片段长度，见表1。HIF1α及βactin反应参数为：95℃5 min；95℃ 30 s，53 ℃30 s，循环35次；72℃ 5 min；4 ℃终止反应；HIF2α、3α反应参数：95℃5 min；95℃ 30 s，52℃ 30 s，循环35次；72℃ 5 min；扩增产物进行1.5%琼脂糖电泳，紫外光测定法凝胶显像仪扫描并进行图像分析。用目的基因与βactin吸光度的比值代表目的基因mRNA的相对表达量。表1 HIFα和βactin引物序列及扩增片段长度基因名称序列扩增片段（略）

　　1.4 统计学分析

　　数据以x±s表示，应用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 HE染色结果

　　对照组大鼠心肌细胞呈短柱状，排列整齐、紧密，细胞核致密清晰可见，呈蓝色，组织间无水肿，无或仅有少量中性粒细胞渗出；AMI组术后1 h心肌细胞肿胀变性， 缺血区心肌中少量中性粒细胞浸润，未见明显坏死灶；6 h心肌细胞出现变性，胞浆疏松透明，部分细胞坏死，核消失，细胞界限不清，心肌纤维成波浪状改变，有较多中性粒细胞和红细胞浸润。见图1。

　　2.2 HIFα mRNA表达

　　如图2、表2所示，HIF1α、2α、3α mRNA在正常心肌中均有表达；缺血心肌中HIF1α mRNA 于术后1 h 开始表达明显上调（P<0.05)，2 h达高峰（P<0.01)，4 h后开始下降（P<0.05)，6 h回落至正常水平，12 h维持在正常水平；而缺血心肌中HIF2α、3α mRNA在术后无明显变化（P＞0.05)。表2 HIFα mRNA在各组心肌中的表达(略)

　　3 讨 论
　　
　　HIFs是碱性螺旋环螺旋(bHLH)过碘酸希夫(PAS)超家族成员，由α亚基(HIF1α、HIF2α和HIF3α)和共同的β亚基(HIF1β)组成的异二聚体〔3〕，HIFα是功能性亚基，为氧调节性蛋白；HIF1β为结构性表达蛋白，不随氧分压的变化而变化。HIF1α、HIF2α和HIF3α在bHLH和PAS区保持高度一致，但HIF1α和2α含N端激活区(NAD)和C端激活区(CAD)两个转录激活区，HIF3α在C羧基端缺乏CAD〔4，5〕。HIF1α通过与表达调控区含有其结合序列的一系列基因作用而调节细胞的低氧反应性〔6〕。虽然HIF1和HIF2结合的DNA 序列相似，但各自有不同的靶基因，在不同的组织表达不同，功能不重叠。
　　
　　本研究发现HIF1α、2α、3α mRNA在正常心肌中均有表达，而HIF3α mRNA表达量比HIF1α、2α mRNA低3倍，这与Heidbreder等〔1〕的研究结果基本一致，但从心肌缺血后1 h开始，心肌缺血区中的HIF1α mRNA表达明显上调，2 h达高峰，4 h后开始下降，6 h降到正常水平。AMI一般在发病后6 h病理学才能观察到典型的心肌细胞变性、坏死，而HIF1α mRNA在心肌缺血的早期(缺血后1 h)即可检测出，与朱健华等〔7〕的报道基本一致，提示HIF1α mRNA是反映组织器官缺氧的敏感的指标，可以用于AMI的早期辅助诊断；HIF2α、3α mRNA在术后无明显变化。提示早期的心肌缺血可能与HIF1α密切相关，与HIF2α、3α无明显关系。有研究认为在急性或轻度氧浓度下降时仅HIF3α 发挥转录激活作用，其余的HIFα 亚基在慢性低氧或显著氧浓度下降时发挥转录激活作用，与本实验结果不一致，可能是不同器官在不同氧浓度的缺氧条件下，HIFα mRNA 的表达不同。可见HIF2α 和HIF3α 在低氧状态下的作用与HIF1α 有着明显的不同，可能是它们彼此间存在着不同的转录调控功能和基因结合位点〔8〕所致。
　　
　　HIF1α、2α和3α 在结构上保持高度一致，然而在相同条件（正常和缺氧状态)下的心肌中基因表达却不同，其机制及其在早期心肌缺血中所起的作用有待于进一步的研究。

参考文献

　　1 Heidbreder M，Frohlich F，Johren O，et al.Hypoxia rapidly activates HIF3 alpha mRNA expression〔J〕.FASEB J，2003；17(11):15413.

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　　3 Li QF，Dai AG.Differential expression of three hypoxiainducible factoralpha subunits in pulmonary arteries of rat with hypoxiainduced hypertension〔J〕.Acta Biochim Biophys Sin，2005；37(10)：66572.

　　4 Ema M，Hirota K，Mimura J，et al.Molecular mechanisms of transcription activation by HLF and HIF1alpha in response to hypoxia:their stabilization and redox signalinduced interaction with CBP/p300〔J〕.EMBO J，1999；18(7):190514.

　　5 O′Rourke JF，Tian YM，Ratcliffe PJ，et al.Oxygenregulated and transactivating domains in endothelial PAS protein 1:comparison with hypoxiainducible factor1 alpha〔J〕.J Biol Chem，1999；274(4)：206071.

　　6 Wenger RH.Cellular adaptation to hypoxia：O2sensing protein hydroxylase，hypoxiainducible transcription factors，and O2regulated gene expression〔J〕.FASEB J，2002;16(7):115162.

　　7 朱健华，周 娟，丁 斐，等.缺氧诱导因子1α在大鼠急性缺血心肌组织中的变化〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2007；11(45)：90714.

　　8 王 丽，王素霞，梅长林.RNA干扰对比观察HIF1α和HIF2α在人肾癌细胞中的作用及机制〔J〕.第二军医大学学报，2006；27(6)：5903.