关于小鼠肝癌细胞系Hepa1

　　　　　　作者：杨欣伟，隋延仿，李增山，曲萍，武文，叶菁，董海龙，张秀敏

【关键词】 癌症疫苗
　　【Abstact】AIM: To study the efficacy of antitumor immunity both in vivo and in vitro with B7.1 gene induced into murine hepa16 hepatocellular carcinoma cells. METHODS : pLXSN B7.1 was transfected into packaging cell line PA317 by liposome induction and high titer positive clone was acquired by G418. The expression of B7.1 molecules was detected by FACS. Antitumor immunity in vivo and in vitro was observed following transfection of B7.1 gene into Hepa 16 cell line， which acted as a tumor vaccine. RESULTS: B7.1 molecules were highly expressed in Hepa 16/B7.1， with decreased tumor induction and protective immunity effect. CONCLUSION: Hepa16 hepatocellular carcinoma cells transfected with B7.1 genes as a kind of tumor vaccine can effectively trigger the host antitumor immunity.
　　【Keywords】 mice; carcinoma， hepatocellular ; B7.1; cancer vaccines.
　　【摘要】 目的： 研究小鼠肝癌细胞系Hepa16转染B7.1基因后在体内外抗肿瘤免疫的作用.方法： 采用脂质体介导的方法用pLXSN B7.1转染PA317包装细胞，经G418筛选出高滴度阳性的细胞克隆，以流式细胞仪检测B7.1分子的表达情况；用所获病毒上清进一步感染Hepa16细胞，观察转染B7.1基因后Hepa16细胞作为肿瘤疫苗在体内外诱发抗肿瘤免疫的情况. 结果: Hepa16/B7.1高表达B7.1分子，其致瘤性明显降低，接种小鼠后成瘤率为20%，而亲代Hepa16细胞成瘤率为100%.转B7.1基因肿瘤细胞疫苗可抑制肿瘤生长速度，延长荷瘤小鼠生存期；且转B7.1基因肿瘤细胞疫苗具有保护性免疫反应. 结论:　　 转B7.1基因的肿瘤细胞作为肿瘤疫苗可有效地激发机体的抗肿瘤免疫反应.
　　【关键词】 小鼠；癌，肝细胞；B7.1；癌症疫苗
　　0引言
　　B7分子在T细胞激活过程中提供主要的共刺激信号，其与受体CD28和/或CTLA4分子结合，产生不同的生物学和免疫学效应，体现了机体对免疫自稳的精细正负调节机制.已有的研究证明肿瘤细胞缺乏B7.1分子是其逃逸免疫监视的一个重要机制［１］. 因此在缺乏共刺激分子的肿瘤细胞中导入协同刺激分子制备瘤苗，成为近来肿瘤生物治疗的研究热点.我们应用基因转染的方法，通过逆转录病毒将B7.1基因导入缺乏B7.1分子的小鼠肝癌细胞系Hepa16中，观察转染B7.1基因后其致瘤性及其抗肿瘤免疫效应.
　　1材料和方法
　　1.1材料 BALB/c小鼠90只，雌性，6~8 wk龄，第四军医大学实验动物中心提供. 逆转录病毒载体pLXSNB7.1由本室保存. 逆转录病毒包装细胞系PA317为第四军医大学唐都医院骨肿瘤实验室张惠中博士惠赠. NIH3T3细胞株由第四军医大学免疫学教研室提供. 小鼠肝癌细胞系Hepa16购自中山医科大学实验动物中心. DMEM培养基（高糖）、G418，LipofectAMINE均为Gibco/BRL公司产品. 新生牛血清为杭州四季青产品.
　　1.2方法
　　1. 2. 1细胞培养Hepa16细胞在含100 mL・L-1新生小牛血清的DMEM（高糖）培养基中，37℃， 50 mL・L-1CO2条件下培养.包装细胞PA317和NIH3T3细胞培养条件同上，每4 d更换液体１次，长满后传代处理.
　　1. 2. 2重组逆转录病毒的获得及滴度测定用LipofectaMINE(Gibco /BRL)将质粒pLXSNB7.1转染至PA317病毒包装细胞系中，G418筛选阳性转染细胞，采用NIH3T3细胞为受测细胞，行滴度测定，以如下公式计算病毒滴度：

　　Ｇ418R(cfu・L-1)=(No.of clonies)/［virus volum(L-1)×replication factor×fraction of infected cell plated］
　　1. 2. 3转染肝癌细胞表面B7.1分子的表达情况用所获病毒上清进一步感染Hepa16细胞，G418筛选阳性克隆; 用流式细胞仪检测Hepa16/B7.1细胞表面B7.1分子的表达.
　　1. 2. 4转B7.1基因肝癌细胞的生长特性 接种1×105 转染前后细胞于24孔板中，每1例接种3个复孔，从接种第2日起对3个复孔进行细胞计数，取平均值，连续9 d，第4～5日更换液体1次，绘制细胞生长曲线.
　　1.2.5转B7.1基因肝癌细胞体内致瘤性将小鼠随机分3组，每组10只，分别于皮下接种肝癌细胞株Hepa16／B7.1，Hepa16/Neo和亲代Hepa16， 细胞总数为5×106 . 每周2次用游标卡尺记录肿瘤大小并观察小鼠生长情况.
　　1. 2. 6转B7.1基因肿瘤细胞疫苗的制备及治疗实验① 荷瘤鼠模型制备：于每只小鼠右背部皮下接种5×106 亲代Hepa16细胞，共0.2 mL. 约7~10 d后肿瘤结节长至0.5 ~0.6 cm ×0.5 ~0.6 cm时开始治疗实验.②肿瘤细胞疫苗的制备：收集对数生长的Hepa16及Hepa16/B7.1细胞，调细胞数至5×109・L-1，用100 g・L-1 丝裂霉素C灭活2 h，洗去丝裂霉素，用无血清RPMI1640调细胞数至2× 1010・L-1 ，备用. 将荷瘤小鼠随机分为3组，每组10只，分别于对侧背部皮下接种Hepa16/ B7.1、亲代Hepa16细胞及生理盐水，每周2次，共6次，观察肿瘤大小变化及动物生存期. 肿瘤体积用公式V=ab2/2计算. a为长径，b为短径.
　　1. 2. 7转B7.1基因肿瘤细胞疫苗的免疫保护作用以丝裂霉素灭活的Hepa16/B7.1， Hepa16/Neo及亲代Hepa16 肿瘤细胞作为疫苗免疫BALB/c小鼠，15 d后接种未照射的亲本Hepa16细胞，观察小鼠成瘤情况及生存期.
　　2结果

　　2.1逆转录病毒的包装及转染肝癌细胞表面B7.1分子的表达情况用LipofectaMINE转染pLXSNB71至PA317细胞中，G418筛选得到多个克隆，选择高表达PA317株，用NIH3T3测定滴度，最高滴度为1.5×108 CFU・L-1. 用流式细胞仪检测Hepa16/B7.1细胞表面B7.1分子的表达（Fig 1）.
　　图1B7.1基因表达的FCM分析（略）
　　Fig 1 FCM analysis of B7.1 gene expression（略）
　　2.2转染肝癌细胞的生长特性 转染的肝癌细胞与亲本Hepa16细胞在形态、生长速度及增殖能力上无明显差异， 转染前后Hepa16 细胞的生长呈上升曲线(Fig 2).
　　■:Hepa16;●:Hepa16/B71.
　　图2转染前后Hepa16细胞生长曲线（略）
　　Fig 2Growth curves of Hepa16 cells before and after transfection（略）
　　2.3转B7.1基因肝癌细胞体内致瘤性观察转B7.1基因Hepa16细胞成瘤性降低，接种小鼠后成瘤率为20%，并可保持无瘤状态长期存活. 而亲本Hepa16细胞成瘤率为100%，接种BALB/c小鼠后肿瘤呈进行性生长，小鼠在45 d内死亡.
　　2.4转 B7.1基因肝癌细胞疫苗的治疗作用 转B7.1基因肿瘤细胞疫苗可抑制肿瘤生长速度，使荷瘤小鼠生存期明显延长，结果见Fig 3.
　　2.5B7.1基因肝癌细胞疫苗的免疫保护作用以丝裂霉素灭活的Hepa16/B71，Hepa16/Neo及亲代Hepa16肿瘤细胞作为疫苗免疫Balb/C小鼠，15 d后接种未照射的亲本Hepa16细胞，结果表明：丝裂霉素灭活的Hepa16/Neo及亲代Hepa16细胞成瘤率100％，平均生存时间不足50 d；而经Hepa16/B71免疫后的小鼠肿瘤生长受抑，生存时间延长，平均生存时间超过120 d，且40％小鼠能够长期无瘤生存 (Fig 4) .
　　■:Hepa16;●:Hepa16/B71;▲:NS.
　　图3转 B7.1基因肝癌细胞疫苗的治疗作用（略）
　　Fig 3 Treatment of Hepa16 cells vaccine transfected with B7.1（略）
　　■:Hepa16;●:Hepa16/B71;▲:NS.
　　图4治疗组与对照组小鼠生存期比较（略）
　　Fig 4Survival period of control groups and therapeutic group（略）
　　3讨论

　　近年来，人们逐渐认识到肿瘤细胞的抗原不能被识别或产生应答在一定程度上与抗原递呈的缺陷有关，利用共刺激分子B7.1可显著增强肿瘤的抗原性，使其在肿瘤生物治疗中发挥其作用［2，3］.B7.1分子与其在T细胞和NK细胞表面的配体CTLA4和/或CD28相互作用，可增强淋巴细胞对靶细胞和抗原递呈细胞的识别，导致T细胞增殖和一些细胞因子如IL2，IFNγ，TNFα，GMCSF等表达增高，对CD8+或CD4+ T细胞产生直接的共刺激作用，大大增强淋巴细胞的杀伤作用而导致肿瘤细胞被杀伤或抑制［4，5］. 研究表明，大多数小鼠及人类肿瘤细胞均不表达B7分子［６］，如肝癌、宫颈癌、胃癌等细胞均不表达B7.1分子［７］，在肝细胞肝癌上，B7.1，B7.2低水平的表达，不能为T细胞活化提供所必需的共刺激信号［１］，不能引起有效的抗肿瘤免疫应答［８］，成为肿瘤细胞逃逸免疫排斥反应的一个重要原因. 有实验证实，将B7基因导入肿瘤细胞后可增强其免疫原性［３］. 但转染B7基因的肿瘤细胞所诱导的抗肿瘤免疫反应强弱程度相差甚远［４，６，９－１１］，可能是因为不同的肿瘤细胞免疫原性强弱、MHC分子和辅助刺激分子(如ICAM1， LFA3)表达水平不同，所以导致所诱导的免疫反应强弱不同.吴义传等［１２］将B7.1，B7.2的真核表达载体转染UMR106骨肉瘤细胞系，经流式细胞仪检测，结果发现B7.1，B7.2的表达分别提高了41％和27％. B7基因能通过增强自然杀伤细胞的活性杀伤低免疫原性肿瘤［１３］ ， 还能给γ、δΤ淋巴细胞提供共刺激信号，促进其对肿瘤的杀伤，增强机体免疫系统对肿瘤的攻击［１０］， 并可抑制肿瘤转移［１４］.因此在缺乏共刺激分子的肿瘤细胞中导入协同刺激分子制备瘤苗成为近年来肿瘤生物治疗的一大热点.
　　免疫基因治疗的一个主要目的就是提高肿瘤细胞的免疫激活能力，藉此能够刺激机体产生强大的抗肿瘤效应. 本研究中，我们应用逆转录病毒载体将小鼠B7.1基因转入小鼠肝癌细胞Hepa16中，经丝裂霉素Ｃ处理制备瘤苗后观察其生长特性、致瘤性、免疫治疗及免疫保护作用. 结果表明转B7.1 基因后肿瘤生长特性无明显变化，致瘤性降低；该瘤苗可对同系肝癌细胞产生免疫保护和较好的免疫治疗效果；证实了小鼠肝癌Hepa16模型中B7.1分子的表达能有效地刺激局部的抗肿瘤排斥反应，延长荷瘤小鼠生存期，说明B7.1基因修饰的肿瘤细胞可诱导机体产生抗肿瘤免疫反应.
　　随着肿瘤免疫学和细胞生物学的研究进展，肿瘤生物治疗可望成为做手术、放疗、化疗之后的第四种治疗方法. 应用共刺激分子基因治疗为基础的肿瘤免疫治疗方法显示了其良好的应用前景，本实验结果表明转B7.1基因肿瘤细胞疫苗可诱发机体的抗肿瘤免疫效应并具有免疫保护作用，具有潜在的临床应用价值. B7.1基因是肝癌免疫基因治疗的一个很好的备选基因，有望在肿瘤生物治疗中发挥一定的作用［１４］.
　　

参考文献

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