作者：邹自英，朱运龙，王高峰，钟延清，周华，刘亚莉
【关键词】 宫颈肿瘤
【Abstract】 AIM： To investigate whether tamoxifen is involved in the proliferation of cultured HeLa cell line， which is derived from cervical carcinoma cell line of human beings. METHODS： The level of cell proliferation was assessed by drawing the proliferation curves of HeLa cells， detecting OD value of MTT assay and using flow cytometry and laser scanning confocal microscope. RESULTS： Tamoxifen (1×10-7 mol・L-1) shifted the curve upward. Tamoxifen (1×10-8~1×10-6 mol・L-1) significantly stimulated the cell proliferation and facilitated (1×10-6 mol・L-1) G1/S transfer of the cell cycle as well as greatly increased the releasing of Ca2+ in the cells. CONCLUSION： Tamoxifen may modulate the proliferation and the differentiation of cultured HeLa cervical carcinoma cells by affecting the cell cycle and Ca2+ in the cells.
【Keywords】Tamoxifen; cervix neoplasms;cell pision
【摘要 】 目的： 研究他莫西芬（tamoxifen， TAM）对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响. 方法： 应用生长曲线测定、MTT、流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜等技术. 结果: TAM（1×107mol・L1）使HeLa细胞的生长曲线向上移动；TAM（1×108~1×106 mol・L1）可显著促进HeLa细胞增殖；TAM（1×106 mol・L1）促进细胞G1/S期转化，并显著促进细胞内Ca2+释放. 结论： TAM可能对子宫颈癌细胞的生长和分化具有重要的调节作用，这种调节作用可能是通过影响细胞周期和胞内Ca2+水平而实现的.
【关键词】 他莫昔芬;宫颈肿瘤;细胞分裂
0引言
他莫西芬（tamoxifen， TAM）既是雌激素的拮抗剂又是其协同剂，这取决于雌激素受体是激活还是抑制靶基因.例如，TAM 在乳腺组织可拮抗雌激素的效应，而在子宫和骨组织又是雌激素的协同剂 ［1］.TAM 可在子宫、乳腺和垂体等部位产生不同活性.有关TAM对宫颈癌HeLa细胞的影响，尚不清楚.我们应用生长曲线测定、MTT、流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜等技术研究了TAM对HeLa细胞的作用，以便探讨临床使用TAM治疗乳腺癌时可能会对子宫产生副作用的原因.
1材料和方法
1.1材料HeLa 宫颈癌细胞系（第四军医大学基础部遗传与发育生物学教研室杨曦惠赠），DMEM培养基（美国Gibco）， 新生小牛血清（杭州四季青生物工程研究所），胰蛋白酶（Difco）， TAM(Sigma)， MTT(华美生物公司)，二甲基亚砜（Serva公司），furo3/AM(Sigma)，酶联免疫检测仪（Beckman）， Elite ESP 流式细胞仪（Coulter公司），激光扫描共聚焦显微镜（BioRad）.
1.2方法
1.2.1HeLa细胞系培养将HeLa 细胞培养于DMEM培养基（DMEM 1 L中加Hepes 3.57 g，NaHCO3 2 g），置于37℃，50 mL・L1CO2 培养箱中.培养的HeLa细胞可重叠生长，每3 d传代.传代时，移去旧培养液，DHank′s液冲洗2次，11加入EDTA和胰酶，消化2.5 min，离心后重悬于新培养瓶中，传代率为12或13.
1.2.2生长曲线的测定细胞按常规传代方法离心悬浮后，在倒置显微镜下用记数板记数，调整细胞数为1.8×107・L1，1 mL/孔接种24孔板，在37℃，50 mL・L1CO2的培养箱继续培养.从第2日始，每日取3孔细胞进行记数，取平均值，共记数7 d.记数到第4日，给未记数细胞换新培养液.
1.2.3MTT比色实验用含50 mL・L1小牛血清的DMEM将细胞制成5×107・L1的细胞悬液，接种于96孔培养板内，每孔100 μL.实验设阴性对照组和各种TAM药物浓度(1×109，1×108，1×107和1×106 mol・L1)实验组.每孔加入含50 mL・L1小牛血清的DMEM配制的药液100 μL，每种药物浓度8个孔，48 h后，每孔加入20 μL浓度为5 g・L1的MTT，37℃培养箱继续培养4 h，去上清后，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡器振荡10 min，测A490 nm值.
1.2.4流式细胞术细胞等量接种于2个25 mL培养瓶，第2日弃旧培养液，加入以含50 mL・L1小牛血清的DMEM稀释的TAM（1×106 mol・L1）药液2 mL，37 ℃培养箱培养48 h后，收集细胞.消化下来的细胞用2.5 mL PBS洗涤2次（800~1000 r・min1离心，5 min），弃上清；加入1 mL PBS将细胞混匀，再加入2 mL无水乙醇立即振荡混匀，封口膜封口，4℃冰箱保存备用.送检时，用PBS洗涤2次，弃除无水乙醇，加100 μL PBS将细胞吹散，调整细胞数为6×108・L1，碘化丙锭染色，用流式细胞仪测定DNA含量，分析用药后细胞周期的变化.
1.2.5细胞内钙的测定将HeLa细胞以2×108・L1接种于特制的培养皿中，培养48 h，用DHank′s液洗涤2次，在37℃烘箱内用furo3/AM(10 μmol・L1)荷载50 min，再用DHank’s液洗涤2次，用共聚焦显微镜扫描加TAM前细胞内钙的荧光强度，向培养皿中心滴加100 μL TAM(1×106 mol・L1)，用共聚焦显微镜动态扫描加药后细胞内钙荧光强度的变化.
统计学处理:实验所得数据均以x±s表示，每组为8个孔，实验重复3次，以t检验结合单因素方差分析判断两组数值间差异的显著性.
2结果
2.1HeLa 细胞生长曲线的测定和TAM对HeLa细胞增殖的剂量效应通过测定HeLa细胞的生长曲线发现，细胞从传代2 d开始就有生长增殖趋势，TAM（1×107 mol・L1）可显著促进HeLa 细胞增殖，使生长曲线上移（Fig 1）.镜下观察发现，细胞传代后4 h就可贴壁，8 h后细胞大部分恢复扁长形，24 h后细胞呈现活跃的生长增殖现象.30 h后加药作用48 h， MTT法测定结果表明，与正常对照组比较，TAM (1×108~1×106 mol・L1)可显著促进HeLa细胞增殖(P&<0.05).1×109 mol・L1的TAM(103±016)对HeLa细胞吸光度值无显著影响.
2.2TAM促进HeLa细胞增殖的流式细胞仪分析HeLa 细胞在1×106 mol・L1 TAM的条件下培养48 h后分析细胞周期的变化，结果发现TAM显著的促进细胞的G1/S期转化，G1期的比例从55.5%下降到32.8%，而S期的比例从29.0%上升到49.4%，G2期的比例从15.5%上升到17.8%.
■: Normal; △: Treated with tamoxifen.
图1HeLa 细胞生长曲线及他莫西芬的影响（略）
Fig 1Proliferation curve of HeLa cells and the effect of tamoxifen(1×107 mol・L1)（略）
2.3TAM对细胞内钙的影响由Fig 2可见，TAM (1×106 mol・L1)可明显促进细胞内Ca2+释放.后3 s(16 s，17 s和18 s)的荧光强度（126±35）比前3 s(13s，14 s和15 s)（110±32）明显增强（B），反应在曲线图（A）上加TAM后曲线向上移动，并有持续的升高趋势；反应在半高图（C）上为荧光高度后3 s比前3 s明显升高.
3讨论
TAM是一种非类固醇类抗雌激素药物，广泛用于乳腺肿瘤的治疗，对正常垂体细胞的激素分泌和增殖也有抑制作用.已有研究证明，雌激素对不同细胞类型可分别产生促增殖、引导分化和促进细胞死亡等不同效应，植物性雌激素木黄酮可以抑制培养的人垂体瘤细胞的生长［2］，体内雌激素水平与骨质疏松症的发生密切相关［3］.TAM作为医疗上重要的抗雌激素药物，在雌激素受体阳性的细胞内可促进细胞死亡.在转染的雌激素受体阳性的HeLa 细胞，雌激素和4羟基TAM分别使p38的活性提高12~36倍和2~5倍，从而引起细胞的凋亡［4］.TAM是闭经妇女乳腺癌各阶段内分泌治疗的一线药物，因而，研究其对相关器官有何影响具有重要意义.
图2他莫西芬使细胞内的Ca2+浓度升高（略）
Fig 2Tamoxifen(1×106 mol・L1) increased the Ca2+ in HeLa cells（略）
在大鼠的研究表明，TAM 促进肝癌细胞增生，在人体的研究也表明，长期使用TAM治疗乳腺癌，可能会使肝癌的发病率大大升高［8］.TAM 是PKC通道的弱抑制剂，使用比治疗乳腺癌高几倍浓度的TAM可通过部分抑制PKC通道而抑制恶性胶质瘤的生长.此外，PKA通道也参与TAM的调节作用，Miller等［9］发现，TAM可调节PKA调节蛋白亚基iα的表达水平，从而使PKA在耐药性机制中发挥作用.另外，EGFR和CerbB2的表达也使乳腺癌对TAM产生耐药性.
TAM在不同的组织可产生完全相反的作用，比如，在乳腺组织起雌激素拮抗剂作用，而在子宫和骨组织则起雌激素协同剂作用［1］.已有研究证明，雌激素在生理浓度（≤1×106mol・L1）时可促进HeLa细胞的增殖［10］，提示TAM对宫颈癌细胞的增生具有相似的效应.本研究证明，TAM(1×108~1×106 mol・L1)可显著促进培养的HeLa细胞增殖，提示TAM在治疗乳腺癌的过程中，可能会引起子宫颈的病变.TAM (1×106 mol・L1)显著促进细胞周期由G1期向S期转化，并可使细胞内Ca2+浓度升高，表明TAM的促细胞增殖效应可能是通过影响细胞周期和胞内Ca2+水平而实现的.
综上所述，TAM在诱导某些肿瘤细胞凋亡的同时，可能会促进其他某些细胞的增生.我们的实验表明，在应用TAM治疗乳腺癌的同时，要注意预防宫颈癌的发生.
参考文献
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