作者：闫志强，李志超，李志斌，宋景春，魏敏
【关键词】 心钠素
【Abstract】 AIM: To study the protective effect of atrial natriuretic peptide (ANP) on alveolar typeⅡ cells (ATⅡ) from lipopolysaccharide (LPS) induced acute lung injury (ALI). METHODS: Eighteen rats were pided into 3 groups: Control group were injected physiological saline through jugular， LPS group were injected LPS and physiological saline through jugular and ANP group were injected LPS and ANP through jugular. Four hours later， rats were sacrificed and the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected. Surface tension， total phospholipids (TPL)， total protein (TP) and maleic dialdehyde (MDA) content of the BALF were measured. The activity of lactate dehydrogenase (LDH) and alkaline phosphatase (AKP) in BALF were detected. RESULTS: Compared with those of control group， LPS can increase the TP content and the activity of LDH ［Control Group (4.8±1.9) μkat/L， LPS Group (8.4±1.9) nkat/L in BALF (P&<0 .05)， which could be reversed by ANP (5.1±1.7) μkat/L］. TPL ［(0.43±0.04) vs (0.34±0.06) μg/kg］ increased and surface tension ［(19.8±2.6) vs (23.3±2.9) mN/m］ decreased in LPS group (P&<0.05)， but no difference was found between ANP group ［TPL (0.41±0.06) μg/kg; surface tension (18.6±2.9) mN/m］ and control group. ANP prevented the increase of the AKP activity ［Control Group (0.10±0.08) μkat/L， LPS Group (0.36±0.10) μkat/L， ANP Group (0.14±0.09) μkat/L］ and the content of MDA in BALF (P&<0.05) induced by LPS. CONCLUSION: ANP can protect the lung from injury by LPS in ALI. One of the most important mechanisms is possibly that ANP can protect the ATⅡ and facilitate the secretion of PS.
【Keywords】 atrial natriuretic factor; pulmonary surfactants; respiratory distress syndrome， adult
【摘要】 目的：研究心房钠尿肽(ANP)对急性肺损伤时肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)的保护作用及其机制. 方法：SD大鼠18只随机等分为生理盐水对照组、脂多糖(LPS)模型组、ANP治疗组. 通过颈外静脉给药，给药4 h后处死动物，收集肺泡灌洗液(BALF)，测定BALF表面张力、总磷脂含量(TPL)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(AKP)、丙二醛(MDA)及总蛋白(TP)含量. 结果：与对照组比较， LPS可使BALF中LDH活性［(4.8±1.9)，（8.4±1.9） μkat/L］及TP含量升高(P&<0.05)，ANP［(5.1±1.7) μkat/L］可逆转此现象；LPS可使BALF中TPL［(0.43±0.04) vs (0.34±0.06) μg/kg］明显降低(P&<0.05)、表面张力［(19.8±2.6) vs (23.3±2.9) mN/m］升高(P&<0.05)，ANP治疗后TPL［(0.41±0.06) μg/kg］升高、表面张力［(18.6±2.9) mN/m］降低；与对照组比较，LPS组AKP活性［(0.10±0.08) vs (0.36±0.10) μkat/L］升高(P&<0.05)，ANP治疗后AKP［(0.14±0.09) μkat/L］明显降低；ANP能逆转LPS引起的MDA含量升高. 结论: ANP能减轻LPS引起的急性肺损伤，其机制可能与ANP保护ATⅡ并促进其分泌表面活性物质有关.
【关键词】 心钠素;肺表面活性物质;呼吸窘迫综合症，成人
0引言
急性肺损伤(ALI)是由多种原因引起的常见的临床急性危重征，机制复杂、治疗手段有限，尤其是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)阶段，死亡率高达50%以上. 内毒素脂多糖（LPS）引起肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)损伤及肺表面活性物质(PS)减少，使肺泡表面张力增加，肺顺应性下降，引起肺不张，导致肺内分流增加，加重低氧血症，是ALI及ARDS的主要病理变化之一. 心房钠尿肽(ANP)是一种含28个氨a基酸的活性多肽，具有较强的扩张血管、利钠、利尿等作用. 目前临床已有应用ANP治疗原发性高血压、肾功能不全、心功能不全、孕高症、脑水肿、肝硬化腹水和青光眼的报道，并取得可靠疗效. 在呼吸系统有ANP受体广泛分布，在ATⅡ主要有NPA，NPB两型［1］，且肺是右心房释放ANP后的第一个靶器官，所以ANP可能对肺循环和肺通气功能具有重要的调节作用. 我们利用大鼠复制的LPS急性肺损伤模型研究ANP对ATⅡ的保护作用，以期揭示在ALI中ANP对肺组织的保护机制，为ALI的治疗提供新思路.
1材料和方法
1.1材料
成年SD大鼠18只，体质量200～250 g，雌雄各半，第四军医大学实验动物中心提供； ANP，LPS购自美国Sigma公司；碱性磷酸酶(AKP)，乳酸脱氢酶(LDH)，丙二醛(MDA)试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品；磷标准溶液由第四军医大学预防系营养与食品卫生学教研室高双斌高级实验师惠赠；725C型紫外可见分光光度计(上海).
1.2方法
1.2.1实验分组及模型建立将动物随机等分为3组：①对照组(n=6)，经颈外静脉导管注射等容积生理盐水; ②LPS组(n=6)，经颈外静脉导管注射LPS 2 mg/kg复制ALI动物模型，注射LPS后再立即注射等容积的生理盐水；③ANP组(n=6)，经颈外静脉导管注射LPS 2 mg/kg后立即注射ANP 2 μg/kg.
1.2.2手术及标本采集大鼠腹腔注射200 g/L乌拉坦5 mL/kg，麻醉后固定于鼠板;沿颈部正中切开皮肤，分离一侧颈外静脉，插入导管给药，给药后4 h颈椎脱臼处死，行气管插管术，以20 mL/kg的生理盐水进行支气管肺泡灌洗，连续3次，取第１次灌洗所得肺泡灌洗液(BALF) 0.2 mL用于表面张力的测量，收集所有BALF并记录BALF回收量，1000 r/min离心10 min，取上清，留1.4 mL于-20℃保存，用于测AKP，MDA，LDH和总蛋白(TP)等，剩余上清用于磷脂提取.
1.2.3表面张力的测定毛细管法测定肺泡BALF表面张力，即将毛细玻璃管垂直插入到BALF中，测量毛细管内外液面高度差，根据拉普拉斯方程σ=rρg(ｈ+ｒ/3)/2计算出BALF的表面张力，以此来反映PS的活性. 其中，σ为表面张力(单位为 Ｎ/ｃｍ)，ｒ为毛细管半径，ρ为液体密度，ｇ为重力加速度，ｈ为内外液面高度差.
1.2.4总磷脂(TPL)的测定采用Bartlett法［2］略有改进. BALF中加入２倍体积的氯仿甲醇（2∶1，V/V）萃取液，震荡1 min，2500 r/min离心10 min，弃上层液体但不弃界面杂质. 加入1/4体积的甲醇水（1∶1，V/V）萃取液，震荡1 min，2500 r/mim离心10 min. 弃去上层液及界面杂质，氮气吹干，即得到磷脂，-20℃保存待测. 将磷脂加入1 mL高氯酸加热，温度由低到高逐渐上升，直至颜色由黑变白表示磷脂完全氧化，继续加热蒸干高氯酸. 磷钼蓝比色法测定样本中无机磷含量. 根据磷脂中磷含量约为0.04，算出磷脂含量，再算出每公斤体质量的磷脂含量.
1.2.5BALF中AKP，MDA，LDH和TP的测量根据试剂盒说明书测量BALF中AKP，MDA，LDH 的含量. 考马斯亮蓝G250染色法测定TP含量.
统计学处理：实验数据均以x±s表示， 组间差别以完全随机设计资料的方差分析进行统计学分析， P&<0.05认为有统计学差异.
2结果
2.1ANP对ALI的治疗作用LPS可使BALF中TP含量及乳酸脱氢酶活性升高，ANP治疗后TP含量及乳酸脱氢酶活性降低；LPS可使BALF中MDA含量升高，ANP治疗后可逆转LPS引起的MDA含量升高(Tab 1).表1ANP对急性肺损伤的治疗作用（略）
2.2ANP对ATⅡ的保护作用LPS可使BALF中AKP活性升高，ANP治疗后AKP活性明显降低，和对照组无明显差别； LPS可使BALF中总磷脂明显降低、表面张力明显升高，ANP治疗后总磷脂升高、表面张力降低，和对照组无明显差别(Tab 2).表2ANP对肺泡Ⅱ型上皮细胞的保护作用（略）
LPS是内毒素的主要生物活性成分，具有极强的生物活性. 肺是内毒素的主要靶器官之一，G-菌感染、内毒素血症是ALI， ARDS和多器官功能衰竭发生的常见原因，其病死率高达50%. ATⅡ损伤及肺表面活性物分泌减少，是ALI及ARDS的发生发展的主要机制之一［3，4］. 郑闵琴等［5］研究证明，LPS能使PS含量及活性下降，ATⅡ肿胀、变性、板层小体减少，肺组织面积密度增加. 本实验中LPS可使BALF中TP含量升高及LDH活性升高，符合ALI表现. TP含量升高表明肺泡渗出增加，LDH是胞内酶， BALF中LDH活性增加表明细胞损伤加重. LPS组BALF中MDA含量升高，脂质过氧化作用增强. AKP是ATⅡ的特异性分化标志， LPS可使BALF中AKP活性增强，表明LPS对ATⅡ有损伤作用. 磷脂是PS的主要成分，TPL能反映PS含量变化. 本实验利用定磷法测量BALF中TPL，结果表明LPS可使BALF中TPL降低. 其机制可能为内毒素血症时，肺血流阻力增加，肺组织缺血、缺氧损伤ATⅡ及LPS对ATⅡ的直接毒性作用，从而使PS合成和释放减少，导致肺表面张力增高.
研究表明ANP对ALI有治疗作用，但机制不清. 目前已知ANP在呼吸系统的作用主要有：扩张支气管、降低肺动脉压、调节通透性［6-8］. 本室研究表明ANP可阻止LPS引起的动脉血压的持续下降［9］；治疗剂量的ANP可有效抑制TNFα， IL8， ET1等细胞炎性因子的分泌，减轻家兔油酸型肺水肿，其机制是通过抑制炎性细胞因子的产生，保护肺组织的完整性，减少肺水形成［10］. 本实验中ANP可逆转LPS引起的BALF中TP， MDA含量及LDH， AKP活性的升高，能使BALF中TPL水平及表面张力恢复. 说明ANP对LPS所致的ALI有治疗作用，其机制可能与ANP减轻LPS对ATⅡ的损伤，促进PS的合成分泌，降低肺泡表面张力有关，但具体机制尚有待于进一步研究.
参考文献
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