作者:邢小红,吴元明,王哲,王文勇,黄高
【关键词】 克隆分子
【Abstract】AIM: To clone the human bit1 cDNA gene and express it in E. coli. METHODS: Total RNA was extracted from fresh placenta tissue and reverse transcripted to single chain cDNA. By using it as the template, the human bit1 cDNA gene was amplified. The cDNA gene was then cloned into pUC19. After the sequence was verified, the cDNA gene was subcloned into pGEX4T3 for expression. RESULTS: The human bit1 cDNA gene was amplified by using the designed primer and the gene was expressed in E.coli induced by IPTG. The expressed protein accounted for 40.6% of the total amount of protein. CONCLUSION: The human bit1 cDNA gene is amplified and expressed in E.coli, which is important for the study on the function of human bit1 protein.
【Keywords】 DNA, complementary; cloning, molecular; sequence analysis; gene expression
【摘要】目的: 克隆并在大肠杆菌中表达人bit1 cDNA基因. 方法: 从新鲜的胎盘组织中提取总RNA,经反转录成单链cDNA, 以此为模板扩增出人bit1 cDNA基因,将该基因克隆入载体pUC19中,测序正确后亚克隆入表达载体pGEX4T3中进行表达. 结果: 利用所设计的引物扩增出完整的人bit1 cDNA基因.以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得表达,激光薄层扫描显示表达蛋白占总蛋白的406%. 结论: 获得了人bit1 cDNA基因及其原核表达产物,对研究人Bit1蛋白的功能具有重要的意义.
【关键词】 DNA,互补; 克隆分子; 序列分析; 基因表达
0引言
凋亡,又称程序性细胞死亡,是机体细胞的一种不可逆的生理过程.机体内存在多种影响细胞凋亡过程的因素.Bcl2就是机体内最重要的凋亡调节因子之一.Jan等[1]通过bcl2基因启动子来筛选能调节bcl2基因表达的细胞分子时获得了bit1(bcl2 inhibitor of transcription 1)基因.bit1基因定位于17q232,其mRNA长约1 kb,编码179 aa的蛋白质,Bit1蛋白Mr约27 000. Bit1蛋白的N端为一线粒体定位序列,C端为一未知功能结构域UPF0099.Northern杂交显示bit1基因在前列腺、骨骼肌、肝脏高表达,而在心脏、脾、结肠低表达.人胸腺及外周血白细胞中几乎检测不到它的表达.Bit1存在于线粒体中,如果释放到胞质中,就和AES(aminoterminal enhancer of split)[2]结合并促进细胞凋亡.纤粘连素和细胞的结合可以抑制这种凋亡.虽然Bit1蛋白可以促进细胞凋亡,但其具体的信号转导通路还不清楚.我们拟从人胎盘组织中克隆人bit1 cDNA基因,并在大肠杆菌中进行表达,为进一步研究bit1基因的功能及其与肿瘤发生的关系奠定基础.
1材料和方法
11材料
TRIzol(r) Reagent为Gibco BRL公司产品; Superscipt Ⅱ反转录试剂盒购自invitrogen公司;Pfu DNA 聚合酶为鼎国公司产品;限制性内切酶,IPTG,dNTP, DL2000 DNA Marker购自Takara公司;凝胶DNA纯化试剂盒为赛百盛公司产品;RNase A及其他分子生物学常用试剂均为华美公司产品.Top10菌种由第四军医大学病理学实验室保存.
12方法
121单链cDNA模板的制备用TRIzol(r) Reagent从新鲜的胎盘组织中提取总RNA,提取的RNA用紫外分光光度计进行定量.按照Superscipt Ⅱ反转录试剂盒的说明将提取的总RNA反转录为单链cDNA.
122引物设计上游引物: 5′GGAATTCGCCCTCCAAATCCTTGGTTATG 3′,含EcoRI识别位点;下游引物: 5′CGGGATCCGATGGAGGGGTTGTTGTCATA 3′,含BamHI识别位点;
123人bit1 cDNA基因的扩增以单链cDNA为模板进行人bit1 cDNA基因的扩增.在50 μL反应体系中,加入10×PCR缓冲液5 μL,Taq DNA 聚合酶1 μL(4168 mkat/L), dNTP 1 μL(10 mmol/L)引物各1 μL(20 μmol/ L),cDNA模板1 μL,灭菌去离子水40 μL,混匀并短暂离心后进行循环反应.反应条件为: 94 ℃ 45 s,61 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,共38个循环,末次循环结束后72 ℃延伸5 min, 4℃保存.PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察,回收DNA条带,用赛百盛试剂盒按说明纯化扩增产物.
124人bit1 cDNA基因的克隆 PCR扩增产物与pUC19载体均用EcoRI和 BamHI 37℃双酶切3 h,酶切产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳及凝胶DNA回收.人bit1基因片段与pUC19载体片段按5∶1摩尔比例,在T4 DNA连接酶催化下,于16℃连接12 h.连接产物转化Top10感受态细胞,37℃振摇培养45 min后涂布于LB平板(含氨苄青霉素100 mg/L),37℃倒置培养36~48 h.随机挑选6个白色菌落(蓝白筛选),分别接种于5 mL含氨苄青霉素的LB培养液中,37℃振摇培养过夜,参照文献[3]以碱裂解法小量提取质粒DNA,经酶切及序列测定鉴定阳性克隆.阳性克隆质粒命名为pUC19Bit1.
2结果
21人bit1 cDNA基因的扩增从新鲜的胎盘组织中提取总RNA经反转录为单链cDNA, 以此为模板扩增出人bit1 cDNA基因,10 g/L琼脂糖凝胶电泳证实扩增片段与理论大小(585 bp)一致(Fig 1).
22人bit1 cDNA基因的克隆将两端带有EcoRⅠ和BamHⅠ的人bit1基因片段克隆入载体pUC19中,得到pUC19Bit1,EcoRⅠ和BamHⅠ双酶消化可得到596 bp的DNA片段(Fig 2),经测序证实所获得的基因片段序列与GenBank数据库所收录的bit1基因序列(登录号为NM_016077)完全一致.
23人bit1 cDNA基因在大肠杆菌中的表达 利用EcoRⅠ和SalⅠ将人bit1基因片段亚克隆入表达载体pGEX4T3中,用BamHI进行酶切鉴定(Fig 3). 将含重组表达质粒pGEX4T3Bit1的菌液于37℃用2 mmol/L IPTG诱导表达,120 g/L SDSPAGE电泳,在Mr 45 000左右有一条新的蛋白带(如箭头所示),而诱导的空载体菌则无此蛋白表达带(Fig 4).随着加入IPTG后诱导时间的延长(1, 2, 3 h),蛋白表达逐渐增高,3 h时达到最高,4 h后开始下降.通过激光薄层扫描分析,表明IPTG诱导时间为3 h时蛋白表达带占细菌总蛋白量的406%.
3讨论
从细菌到人,bit1基因在生物界中非常保守,并与凋亡发生有关.Bit1从线粒体中释放至胞质中以后,可以与AES结合,从而引起不依赖于caspase的细胞凋亡. bit1基因的发现对于研究凋亡的发生与调节提供了新的途径.胞质内Bit1浓度的升高可以明显促进anoikis的发生,而其浓度的降低可以降低anoikis的发生.AES属于TLE(Transducinlike enhancer of split)家族成员,TLE1可以促进细胞存活基因的转录,而Bit1与AES的结合可以关闭这种基因的转录,因而促进细胞凋亡的发生.TLE1的上调表达已经作为淋巴瘤的一个诊断标记[5].那么,Bit1和淋巴瘤或其他肿瘤之间的关系值还需我们进一步研究.
为了研究bit1基因的功能及在肿瘤中的分布情况,我们成功地从人胎盘组织中克隆得到了人bit1 cDNA基因,并在大肠杆菌中得以表达,这为下一步实验奠定了基础.
参考文献
[1] Jan Y, Matter M, Pai JT, et al. A mitochondrial protein, Bit1, mediates apoptosis regulated by integrins and Groucho/TLE corepressors[J]. Cell, 2004;116(5):751-762.
[2] Paroush Z, Finley RJ, Kidd T, et al. Groucho is required for Drosophila neurogenesis, segmentation, and sex determination and interacts directly with hairyrelated bHLH proteins[J]. Cell, 1994;79(5):805-815.
[3] J.萨姆布鲁克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯.金冬雁、黎孟枫译.分子克隆[M].北京:科学出版社,1996:582.
[4] 吴元明,陈苏民,陈南春,等.人Era蛋白在大肠杆菌中的高效表达及纯化[J].第四军医大学学报, 2001; 22(19):1766-1769.
Wu YM,Chen SM, Chen NC, et al. High expression of human Era protein and its purification[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2001; 22(19):1766-1769.
[5] Shipp MA, Ross KN, Tamayo P, et al. Diffuse large Bcell lymphoma outcome prediction by geneexpression profiling and supervised machine learning[J]. Natl Med, 2002;8(1):68-74.